Anti-Cancer Effects of Oldenlandia diffusa extract on WiDr human colorectal adenocarcinoma cells

백화사설초 추출물의 인체 대장암 세포주에서 항암효능에 관한 연구

Abstract

Objectives : The purpose of this study was to investigate the anti-cancer effects of Oldenlandia diffusa extract on WiDr human colorectal adenocarcinoma cells. Methods : We examined cell death by (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) MTT assay and the caspase 3 and 9 activity assay with Oldenlandia diffusa extract. To examine the inhibitory effects of Oldenlandia diffusa extract, we performed a cell cycle (sub-G1) analysis and mitochondrial membrane potential for the WiDr cells after 24 hours with Oldenlandia diffusa extract. Results : 1. Oldenlandia diffusa extract induced cell death in WiDr cells. 2. The sub-G1 peak was increased by Oldenlandia diffusa extract in WiDr cells. 3. Oldenlandia diffusa extract leads to increase the mitochondrial membrane depolarization in WiDr cells. 4. Oldenlandia diffusa extract increases caspase 3 and 9 activities in WiDr cells. 5. Oldenlandia diffusa extract combined with several anti-cancer drugs (paclitaxel, 5-fluorouracil, cisplatin, ectoposide, doxorubicin and docetaxel) markedly inhibited the growth of WiDr cells compared to Oldenlandia diffusa extract and anti-cancer drugs alone. Conclusions : Oldenlandia diffusa extract has an apoptotic role in human colorectal cancer cells and a potential role in developing therapeutic agents against colorectal cancer.

I. 서 론

암은 비정상적인 세포가 통제되지 못하고 과다하게 증식을 통해 확산되는 질병으로, 대장암은 최근 식생활 및 생활습성의 변화로 그 발생 빈도는 점차 증가하는 추세이다1). 국내의 경우 보건복지부 중앙암등록본부의 통계에 의하면 2012년도 기준 암 발생 현황이 갑상선암(20.9%), 위암(16.7%)에 이어 대장암이 세 번째 (14.0%)로 많이 발생하고 있다2).

대장암의 유발 요인은 현대화로 인한 서구형 식생활 변화에 따른 과다한 동물성 지방 섭취 및 섬유질, 칼슘 부족 등의 환경 요인3)과 염증질환 및 대장 용종 등의 유전적 요인이 대부분을 차지하고 있다4,5). 대장암이 발견된 환자의 절반이상은 이미 병기가 3-4기까지 진행된 상태로, 대장암 치료의 어려움이 많다고 알려지고 있다. 대장암 조기 발견을 위해서는 스스로 배변 직후 변 상태를 살펴보는 것인데, 붉은 혈변, 검은색 변, 점액이 많이 섞인 변을 보는 경우, 변이 연필처럼 가는경우, 없던 변비나 설사가 계속되는 경우에는 검사를 받아볼 필요가 있다6). 대장암 치료법으로는 외과적 수술요법, 약물요법, 수술요법 등이 시행되고 있고, 사용되는 치료제 즉 항암제는 암세포 외에도 정상 세포에도 손상을 초래하는 부작용 때문에 면역 기능저하, 골수 기능 장애, 유전인자 손상 등을 야기 한다7). 따라서 부작용을 감소시키면서 암세포에 대한 특이적인 독성을 나타내는 항암제를 합성물질이 아닌 천연물질에서 개발하려는 노력이 시도되고 있다8,9).

백화사설초(白花蛇舌草, Oldenlandia diffusa)는 꼭두서니과에 속하는 일년생 초본으로 흰꽃이 핀다하여 백화, 뱀의 혓바닥처럼 생긴 잎이 돋는다 해서 사설초를 붙여 ‘백화사설초’라 불리고 있다10). 우리나라에서는 제주도 한라산과 전남 등지에서 자라는 것이 발견되고 있다10). 백화사설초가 포함하고 있는 성분 중에는 beta-sitosterol이 있는데 이것은 발암원 으로 유발된 쥐의 대장암을 억제하고11), 항염증 효과12,13) 및 면역증강효과14,15) 등도 있는 것으로 알려지고 있다. 뿐만 아니라 항암효능도 있는 것으로 밝혀져 이와 관련된 연구도 활발하게 진행되고 있는 중이다16,17).

현재 항암제로써의 백화사설초의 효과와 항암제의 효과를 증가시키는 보조제로서의 역할에 관한 체계적인 연구는 이루어지지 않고 있다. 이에 본 연구에서는 백화사설초에 의한 항암효과와 기존에 알려진 여러 개의 항암제에 대한 병용투여로 항암의 효과를 증진시키는 유의한 효과를 얻었기에 이를 보고 하는 바이다.

 

II. 재료 및 방법

1. 재료

1) 약재

실험에 사용한 백화사설초 추출물(이하 ‘백화사설초’라 한다)은 한국생명공학연구원 한국식물추출물은행(Plant Extract Bank)에서 구입한 후 사용하였다. 배화사설초 추출물을 메탄올에 담근 후 15분 동안 초음파 처리한 후 72시간 동안 추출하였다. 추출물은 비 형광 무명(non-fluorescent cotton)에 필터를 한 후 45도에서 회전농축기 (N-1000SWD, Eyela, Japan)를 사용해서 농축하였고, 농축된 추출물은 건조기 (Modul Spin 40 dryer, Biotron Corporation, Calgary, Canada) 감압 하에 24시간 동안 동결 건조하여 사용하였다. 다이메틸설폭시화물 (Dimethyl Sulfoxide (DMSO))에 녹인 후 100 mg/ml 농도로 4도에서 보관하다가 필요 시 희석하여 사용하였다. 다이메틸설폭시화물은 전체농도의 1000분의 1을 넘지 않게 사용하였다.

2) 대상 세포주

이 실험에 사용한 인체 암세포는 서울대학교 암세포주 은행에서 구입한 대장암 세포주 WiDr이며, adenocarcinoma의 Histopathology 특징을 나타내고 있다.

3) 항암제

이 실험에서 사용한 항암제는 cisplastin, ectoposide, doxorubicin, 5-fluorouracil, docetaxel, paclitaxel이다. 이 약들은 DNA나 RNA가 손상되어 세포분열을 제대로 하지 못하는 암세포에 작용하여 apoptosis를 유도한다.

2. 방법

1) 암세포의 배양

암세포주는 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, MD), 1% broad-spectrum antibiotics (Gibco BRL, MD)가 함유된 RPMI-1640 (Gibco BRL, MD) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Precision Scientific Inc. NY)에서 배양하였고, 세포는 0.1% Trypsin-EDTA (Sigma, MD)를 이용하여 37℃에서 5분간 처리한 후 회수하였다.

2) MTT assay

세포 생존율 측정은 세포 배양판 (24-well)에 암세포를 1 ml씩 분주하여 24시간 이상 배양 후 백화사설초를 다양한 농도로 처리한 다음, 37℃, 5% CO2 하에서 72시간 배양한 후, MTT용액 (5 mg/ml)을 배양액 최종 부피의 1/10이 되게 첨가하였다. 3시간 후 배양액을 제거하고 형성된 formazan 침전물을 dimethyl sulfoxide (DMSO) 1 ml로 녹여서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) Flow cytometry를 이용한 세포주기 분석

백화사설초가 WiDr세포의 증식을 억제하는데 있어서 세포주기의 어느 단계를 지연시키는지 flow cytometry를 이용하여 분석하였다. 백화사설초를 첨가한 배지에서 3일간 배양된 WiDr세포를 PBS 용액으로 세척한 후, 4℃에서 30분간 70% ethanol로 고정하였다. 고정 후 propidium iodide (Sigma, MD, USA)로 DNA를 염색하여 Becton Dickinson FACStar Flow Cytometry (Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 세포주기를 비교 분석하였다.

4) Mitochondrial membrane depolarization 측정

Mitochondrial membrane depolarization은 JC-1 fluorescence probe (Molecular Probes, OR, USA)를 이용하여 측정하였다. WiDr세포에 JC-1을 37℃에서 30분 동안 labeling 한 후에 flow cytometry를 이용해서 488-nm excitation과 530/30 또는 585/42 nm bypass emission filters에서 측정하였다. Red fluorescence를 나타내지 않는 세포는 mitochondrial membrane이 depolarization된 것으로 간주하였다.

5) Caspase 3과 9 assay 측정

Caspase 3과 9 assay kits를 BioMol (Plymouth, PA, USA)에서 구입하여 측정하였다. 405 nm의 흡광도(Molecular Devices, Palo Alto, CA)에서 여러 번 측정하였다.

6) 통계 분석

대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 SPSS 16.0 (SPSS Inc, IL, USA)의 Independent t-test를 사용하였으며 유의수준 p<0.05를 사용하였다. 실험결과는 mean ± SD 또는 빈도 (%)로 기재하였다.

 

III. 결 과

1. 암세포 살상 효과

암세포 살상 효과를 측정하기 위하여 백화사설초 50, 100, 200, 300, 400 μg/ml의 농도를 WiDr 세포에 각각 투여한 결과 24시간 후에는 100 μg/ml 이상에서, 72시간 후에는 50 μg/ml 이상에서 뚜렷한 암세포 살상 효과를 볼 수 있었다 (Fig. 1). 24시간 후에는 50 μg/ml에서 94.19 ± 2.1, 100 μg/ml에서 83.75 ± 4.2, 200 μg/ml에서 59.58 ± 6.0, 300 μg/ml에서 47.36 ± 4.3, 400 μg/ml에서 19.08 ± 3.1의 결과를 보였다. 72시간 후에는 50 μg/ml에서 45.36 ± 8.0, 100 μg/ml에서 9.13 ± 5.0, 200 μg/ml에서 5.58 ± 3.2, 300 μg/ml에서 2.99 ± 1.2, 400 μg/ml에서 1.05 ± 1.1의 결과를 보였다. 이러한 결과는 24시간 50 μg/ml을 제외한 모두에서 통계적으로 유의하게 암세포 살상 효과가 있다는 것을 확인한 결과로 50 μg/ml이상 농도에서 항암작용이 있음을 의미한다. 이러한 결과로 이후의 항암제와의 병용투여 실험은 백화사설초 50 μg/ml으로 진행하였다.

Fig. 1.Effect of Oldenlandia diffusa extract on cytotoxicity in WiDr cells.

2. Flow cytometry를 이용한 세포주기 분석

백화사설초에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 flow cytometry를 이용한 세포주기 sub-G1분석을 실시하였다. Apoptosis가 일어나면 기존의 fluorescence peak가 왼쪽으로 이동해 새로운 sub-G1 fluorescence peak가 만들어 진다. 대표적인 결과로 24시간 후 sub-G1 변화가 백화사설초 50 μg/ml에서는 3.80 %, 100 μg/ml에서는 4.10 %, 200 μg/ml에서는 6.30 %, 300 μg/ml에서는 10.2 %, 400 μg/ml에서는 46.50 %의 결과를 보였다 (Fig. 2A). 이러한 결과는 300 μg/ml 이상에서 통계적으로 유의하며 암세포 살상 효과시 백화사설초 농도에 비례해서 sub-G1 peak가 증가함을 알 수 있다 (Fig. 2B).

Fig. 2.Oldenlandia diffusa extract leads to increase apoptosis in WiDr cells.

3. mitochondrial membrane depolarization 확인

백화사설초에 의한 apoptosis 기전을 확인하기 위해서 mitochondrial membrane depolarization assay를 실행하였다. Mitochondrial membrane depolarization은 세포내 intrinsic apoptosis signaling 단계에서 나타나는 현상이다. 24시간 후 50 μg/ml에서 13.1 ± 2.1 %, 100 μg/ml에서 15.2 ± 2.0 %, 200 μg/ml에서 32.4 ± 4.2 %, 300 μg/ml에서 56.2 ± 5.3 %, 400 μg/ml에서 64.3 ± 6.2 %의 결과를 보였다 (Fig. 3). 백화사설초에 의해 mitochondrial membrane depolarization을 증가시킴을 알 수 있다.

Fig. 3.Oldenlandia diffusa extract leads to increase the mitochondrial membrane depolarization in WiDr cells.

4. Caspase 3과 9를 통한 암세포 사멸 확인

백화사설초에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 농도별로 세포사멸의 진행 정도를 알아보았다. Caspase는 cystinyl aspartate-specific protease로 세포질에서 pro-form으로 존재하고 특정 위치의 proteolytic 과정에 의해 활성화된다. 이로 인해 세포의 DNA복제 및 유전자 발현과 관련된 단백질 및 핵의 구조 유지, 세포의 항상성 유지 등과 관련된 단백질들을 파괴시키거나 관련된 단백질을 활성화시켜 apoptosis를 유도하게 된다. Caspase 3와 caspase 9 activity를 측정한 결과 백화사설초에 의해서 caspase 3 와 9 activity가 증가함을 알 수 있다 (Fig. 4).

Fig. 4.Oldenlandia diffusa extract increases caspase 3 and 9 activities in WiDr cells.

5. 대장암 세포주에 미치는 백화사설초와 항암제의 병용처치 효과

대장암 세포주에 미치는 백화사설초와 항암제의 병용처치 효과를 알아보기 위해 백화사설초와 항암제를 함께 투여 하였다. 백화사설초는 세포의 살상효과가 적은 농도로 WiDr에서는 50 μg/ml을 투여하였고, 항암제로는 paclitaxel, 5-fluorouracil, cisplastin, ectoposide, doxorubicin, docetaxel를 투여하였다. 먼저 각 세포에서 항암제 단독의 효과를 관찰한 후 백화사설초와 병용 투여 후 효과를 MTT assay로 관찰하였다. 백화사설초와 병용투여시 항암작용의 효과가 증가하고 있음을 알 수 있지만, paclitaxel과 5-fluorouracil에서는 항암작용이 크게 증가하지 않았다 (Fig. 5).

Fig. 5.Oldenlandia diffusa extract increases the chemosensitivity of WiDr cells.

 

IV. 고 찰

백화사설초는 암, 관절염 또는 자가 면역질환 등 다양한 분야에 많이 사용되고 있다. 하지만 최근에는 암에 대한 항암효능이 알려지면서 항암효능에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 백화사설초는 간암 모델 동물에서 간암세포의 증식과 전이를 억제하고, 세포 사멸을 촉진시키는 것으로 나타나 간암치료 시 좋은 효능이 있음이 알려지고 있다18). 또한 caspase와 GSK-3β의 인산화를 촉진시켜서 난소암 세포(SK-OV-3)의 세포 사멸을 일으킨다19). 유방암세포의 세포사멸도 촉진시키는데 유방암세포에서는 ERα/Sp1에 의한 p53 활성화로 유방암세포를 사멸시키는 것으로 보고되고 있다20). 이와 같이 백화사설초는 다양한 암세포에 대한 항암효능이 계속 보고 되고 있다. 이번 연구에서는 대장암 세포(WiDr)에서 백화사설초의 항암효능을 알아보았다. 백화사설초는 대장암 세포에서 농도 의존적으로 세포 사멸을 일으켰으며 (Fig. 1), 세포주기의 sub G1 peak가 백화사설초 양에 따라 증가함을 알 수 있었다 (Fig. 2). 세포 사멸의 특징 중 하나인 mitochondrial membrane depolarization과 Caspase 활성을 측정해보니 세포사멸의 특징을 나타내었다 (Fig. 3, 4). 백화사설초의 대장암 세포 사멸을 확인한 후에 다양하게 잘 알려진 여러 항암제들과의 병용효능을 알아보았다. 위암, 대장암 등 위장관 계통 암에 많이 사용되는 항암제21)인 paclitaxol, 5-fluorouracil, cisplatin, ectoposide, doxorubicin, docetaxel등을 사용하였다. 이번 실험에서는 그림 5를 보면 백화사설초와의 병용투여에 의한 항암효능은 doxorubicin과 병용투여시 doxorubicin 단독투여시보다 가장 많이 세포 사멸이 나타나 가장 좋은 효능이 나타남을 알 수 있었고, paclitaxol과 5-fluorouracil에서는 병용투여 효능이 크지 않았다. 앞으로 백화사설초의 항암효능 연구에는 doxorubicin이 좋은 항암제가 될 것으로 생각된다. 본 실험실에서 반지련에 의한 위암세포사멸연구에 항암제와의 병용투여 효능도 doxorubicin이 가장 좋은 효능을 나타낸 바 있다22). 따라서 위장관 암계통 연구에 항암제 doxorubicin이 유용하게 사용될 수 있으리라 생각된다.

암은 전 세계 사망원인의 1위를 점하는 질병이며, 앞으로 암 발생은 2020년에는 현재의 2배, 2030년에는 3배에 이를 전망이다23). 지난 수십 년간 전 세계적으로 암의 치료법 및 치료제 연구를 위한 막대한 투자가 이루어졌음에도 불구하고 암의 발생률 및 사망률은 줄어들지 않고 있다. 대장암은 사회적, 경제적 수준이 높은 사람들, 도시 사람들에게 더 흔한 질병으로 대장암의 원인으로는 정제된 탄수화물 음식, 육류, 지방이 많은 음식을 많이 섭취한 식습관이 가장 의심이 되고 있지만, 외부적인 요인은 명확하지 않다24). 대장암 치료에는 수술 요법, 화학 요법, 방사선 요법 등이 있는데 수술요법이 가장 효과적인 대장암 치료법이며 수술요법이 불가능한 경우에 방사선요법과 약물요법이 중심이 된다25). 현재까지 개발된 항암제의 가장 큰 단점은 항암제의 비 특이적 작용이라 할 수 있는데 정상세포까지 영향을 미치기 때문에 원하지 않는 부작용을 나타내는 경우가 많다. 항암제가 암세포 외에 정상적인 세포에도 역시 DNA의 손상을 초래하고 세포가 필요한 영양물질의 흡수를 차단하여 정상세포의 세포분열 및 성장을 방해하는 부작용을 초래하는 경우가 대부분이며26,27), 이러한 부작용은 소화기계통을 비롯하여 간장 장애, 혈액학적 이상, 면역기능 저하, 유전인자 손상 등 다양하게 나타난다6,28).

한약제와 항암제의 병용투여 효능에 관해서는 다양한 연구들이 진행되어 왔는데, 홍화(safflower)6,29), 고삼 (Sophorae Radix)30)등에 의한 대장암 및 위암 세포주 에서의 항암 효능을 연구하였고, 다양한 항암제와의 병용 효능을 알아보았다. 본 논문은 항암효과를 규명한 논문들에 많이 사용되는 항암제중에서 백화사설초와 함께 투여할 때 가장 최선의 효과를 나타내는 항암제를 발견했다는 점에 의의가 있다. 백화사설초에 의한 항암효과는 그동안 많이 연구되지 않은 분야이고, 다양한 항암제와의 병용투여에 관한 체계적인 연구는 이루어지지 않았다. 이번 연구로 위암에 대한 항암 효능 및 항암제와의 병용투여시 백화사설초에 의한 항암작용 상승효과가 있음을 알 수 있고, 따라서 대장암 치료제 개발에 많은 도음이 될 수 있으리라 생각된다. 대장암으로 고생하는 많은 환자들에게 도움이 되어 삶의 질 향상에 도움이 되길 바란다. 암예방 및 항암 효능을 지니는 기능성 소재의 발굴은 사회적으로 매우 필요하며, 그 경제적, 사회적 가치 또한 매우 크다고 할 수 있다. 이에 암예방 및 항암 소재를 발굴하는 연구가 앞으로도 계속 필요하다고 생각된다.