Enzymatic Production and Adipocyte Differentiation Inhibition of Low-Molecular-Weight-Alginate

저분자 알긴산의 효소적 생산과 지방세포 분화 억제 효과

Abstract

In this study, we investigated the extraction condition of alginate from Laminaria japonica, the enzymatic degradation of the extracted alginate, and the inhibitory activity of the degraded alginate on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. The optimal conditions for the efficient extraction, precipitation, and recovery of alginate from the brown seaweed L. japonica were 1% for Na₂CO₃ concentration, 80℃ for extraction temperature, and ethanol for precipitation solvent. In the enzymatic reaction for the production of low-molecular-weight alginate (LMWA) by using alginate lyase from Flavobacterium sp., the initial concentration of Laminaria alginate was 3%. The low-molecular-weight degree from alginate was independent with the enzyme concentration, and the optimal concentration of alginate lyase was found to be 5 unit/ml. Through the enzymatic reaction with 5 unit/ml of alginate lyase at 37℃ for 3 hr, the viscosity and molecular weight of LMWA were 4.5 cp and 307 kDa, respectively. Treatment with LMWA significantly suppressed the accumulation of lipid droplet and triglyceride in 3T3-L1 preadipocytes with a dose-dependent manner. Therefore, it seems that LMWA treatment could inhibit the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. These results indicate that LMWA or the degraded alginate produced by alginate lyase enzyme can be useful for the development of anti-obesity biosubstances.

다시마로부터 알긴산의 효율적인 추출, 침전, 회수조건은 1% Na₂CO₃, 80℃, 에탄올 침전 회수법이였고, 알긴산 분해효소(Flavobacterium sp. 유래 alginate lyase)를 이용한 저분자화 효소 반응 시 최적 초기 알긴산 농도는 3%였다. 알긴산 분해효소 농도에 따른 알긴산의 저분자화 정도에는 큰 차이가 없고, 경제적인 생산 비용을 고려하면 최적의 알긴산 분해효소 농도는 5 unit/ml였으며, 5 unit/ml의 알긴산 분해효소 농도로 37℃에서 3시간 반응하여 저분자화한 알긴산의 점도는 4.5 cp, 분자량은 307,008 Da였다. 3T3-L1 지방전구세포에 저분자화 알긴산을 125 μg/ml, 250 μg/ml 농도로 처리하였을 때 지방과립 형성과 triglyceride 중성지방 축적이 감소됨을 확인하였다. 따라서, alginate lyase로 저분자화된 알긴산은 지방세포 분화억제 효과가 있음을 확인하였다.

서 론

알긴산(alginic acid)은 갈조류의 세포벽 구성 다당류로 건조중량의 약 40%에 달한다고 알려져 있다. 알긴산은 갈조류(곰피(Ecklonia stolonifere), 감태속(Ecklonia), 미역속(Undaria), 다시마속(Laminaria) 등)의 주요 세포벽 구성성분으로 해초산이라고도 하며, 만뉴론산(D-mannuronic acid)과 글루론산(L-gluluronic acid)이 β-1, 4 결합으로 이루어진 이형 다당류이다[3, 5, 6]. 알긴산은 혈청 및 간장 지질의 콜레스테롤 농도를 감소시키고, 지방세포 분화억제 효과와 세포 내 지방세포 유전인자 단백질인 렙틴(leptin)의 함량을 감소시키며, 체내 중금속 흡수 제거효과, 젤형성능, 상처봉합제 등의 의약품 소재 및 기능성 식품소재로 응용되는 등, 알긴산의 약학적, 식품적 효능 또한 우수한 것으로 알려져 있다[9, 19, 21, 23].

만뉴론산과 글루론산의 중합으로 되어 있는 거대분자인 알긴산을 폴리만뉴론산(polymannuronate)과 폴리글루론산(polyguluronate)으로 저분자화하면, 항암 및 항균작용, 면역 증강, 장내세균 군집 개선효과, 항콜레스테롤 효과, 기타 다양한 생체조절기능성이 월등히 높게 나타나고 있음이 보고되고 있다[4, 20, 23].

하지만 다당류인 알긴산 분해의 어려움 및 기존의 산 또는 염기 가수분해 방법은 저분자 알긴산의 분자량 조절 및 정제 등에 어려움이 있었다. 알긴산 분해효소(alginate lyase)를 이용한 방법으로 최근 신규 미생물로 Vibrio crassostreae [1], Shewanella oneidensis [2], Flavobacterium sp. [8], Microbacterium oxydans [11], Pseudomonas aeruginosa [12], Zobellia galactanivorans [22] 등 다양한 미생물이 보고되었으나, 효소 생산에 관한 연구는 archaea chaperonin과의 공발현 생산[14] 외에는 보고된 바 없다. 따라서, 알긴산 분해효소를 이용한 알긴산의 저분자화 공정 관련 연구 보고도 거의 없는 실정이며 저분자 알긴산의 생리학적 기능(효능)에 대한 연구도 상대적으로 낮은 편이다.

이에 본 연구에서는 다시마 알긴산의 추출공정과 알긴산 분해효소 alginate lyase를 이용한 다시마 알긴산의 저분자화 공정을 최적화하고, 이렇게 생산된 저분자 알긴산의 지방세포(3T3-L1) 분화 억제 활성을 검토하여 항비만 또는 다이어트 식품 소재 개발에 활용하고자 한다.

 

재료 및 방법

사용 다시마

부산 기장군 일광면에서 2011년도에 생산한 다시마 중 제품화 과정 중 발생한 건조 다시마 잔여물을 이용하였다. 다시마 잔여물은 정수로 표면을 세척한 후 열풍건조기에서 80℃, 8시간 건조한 후 분쇄기로 분말화(60 mesh)하여 사용하였다.

다시마로부터 알긴산의 추출 및 침전 회수

알긴산 추출법 중 추출 수율이 뛰어난 알칼리(Na2CO3) 가수분해 추출법을 사용하여 알긴산을 추출하였다[24]. 알칼리 농도와 추출 온도를 변화시키면서 얻어진 추출 상등액에 초산을 이용하여 pH 2로 조절한 후 교반 정치하였다. 이 후 gel을 형성한 알긴산을 회수하였고 동량의 에탄올을 첨가하고 염산(HCl)으로 pH 7로 중화한 후 부유한 알긴산을 회수하였다. 회수한 알긴산은 수세 후 4시간 건조하였다.

알긴산의 추출 수율, 분자량 및 점도 측정

다시마로부터 추출한 알긴산의 추출 수율은 사용한 다시마의 원료중량에서 추출 후 얻어진 알긴산의 건조중량으로 계산하였다.

알긴산 추출 수율(%) = 알긴산 건조중량(g) / 시료량(g) ×100

알긴산의 분자량은 GPC (Gel permeation chromatography) 분석을 통하여 측정하였으며 Waters GPC system (Waters, USA)과 검출기 Waters 410 Differential Refractometer와 TSKgel G6000PW (7.8×300 mm) column을 이용하였다. 분석할 알긴산은 pH 7의 증류수에 녹인 후 35℃와 1.0 ml/min의 유속 조건으로 100 μl 시료를 주입하여 분석하고, 분자량 계산을 위하여 표준시료는 polyethylene glycol (PEG)와 polyethylene oxide (PEO)를 사용하였다.

알긴산의 점도는 회전점도계인 Digital Viscometer DV-I Prime (Brookfield, USA)를 사용하여 3회 반복 측정하였다. 알긴산 시료를 1~3% 농도로 증류수에 녹여서 25℃ 조건으로 알긴산 및 저분자화 알긴산의 점도를 측정하였다.

알긴산 분해효소에 의한 알긴산의 저분자화

알긴산의 저분자화 분해를 위해 Flavobacterium sp. 유래 알긴산 분해효소(alginate lyase, SIGMA)를 이용하였다. 반응조건은 조건에 맞는 농도로 알긴산을 증류수에 녹인 후, 알긴산 분해효소를 1 unit/ml, 5 unit/ml, 10 unit/ml로 첨가하여 pH 6.3에서 37℃로 3시간 처리하였고, 10분간 boiling으로 효소 반응을 종료시킨 후 알긴산의 분해 양상을 TLC로 분석하였다. 저분자화 정도를 표준물질(disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide) (11)과 비교하여 확인하였다. 전개용매는 butanol : acetic acid : water (2 : 1 : 1)를 이용하였고, 10% H2SO4 용액으로 110℃에서 15분 발색하여 알긴산의 분해 양상을 분석하였다.

저분자 알긴산은 에탄올을 이용하여 침전시켰다. 침전물을 회수하여 50℃에서 10시간 건조하여 분쇄기로 분말(100 mesh)을 제조하여 저분자 알긴산을 제조하고 지방세포 분화 억제 실험에 사용하였다.

저분자화 알긴산의 지방세포 분화 억제 효과

다시마 유래 저분자화 알긴산(저분자 폴리만)의 지방세포 분화억제 효과를 확인하기 위해 murine 3T3-L1 지방세포를 이용하였다. 먼저 3T3-L1 지방전구세포를 35mm culture dish에 배양한 뒤 confluent 상태가 되게 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. Confluent 상태일 때, 10% FBS, 0.1% gentamycin이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에서 2 일간 더 배양하였다. 그 후 분화배지(10% FBS, 0.1% gentamycin, 10 μg/ml insulin, 0.5 μM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobuthyl-1-methylxanthine (MDI))로 교환할 때 저분자 폴리만을 같이 처리하였다. 2일 배양 후에도 역시 10 μg/ml insulin 이 포함된 DMEM 배지에 저분자 알긴산을 처리하여 3~5일간 배양하였고, 저분자 알긴산을 처리하지 않은 지방세포와 비교하여 Oil Red O staining 을 실시하였다.

 

결과 및 고찰

다시마로부터 알긴산의 추출, 침전 및 회수

다시마 잔여물로부터 알긴산을 황산·알칼리 가수분해법과 알칼리 가수분해법으로 추출하여 추출수율을 비교하였다. 그 결과 22.4%와 21.7%의 알긴산 추출 수율을 보여 두 추출법에서 큰 차이가 나타나지 않았다. 추출의 경제성을 고려하여 공정 단계가 적은 알칼리 가수분해법을 사용하고 이때 추출 온도와 Na2CO3 의 농도에 따른 추출 수율을 측정하였다. 추출 온도에 따라 알긴산 추출 수율은 증가하였지만, 비례적으로 증가하지 않았고, 80 ℃에서부터 수율(23.3%)은 거의 일정하여 추출 온도는 80℃로 결정하였다. Na2CO3의 농도 1% 이상에서는 추출 수율(약 23%)에 유의적인 증가가 없었으므로 최적 Na2CO3의 농도를 1%로 결정하였다. 알긴산을 침전, 회수하는 방법에는 산, 염화칼슘(CaCl2), 및 에탄올이 이용되는데 이들 침전 방법에 따른 추출 수율을 비교하였다. 에탄올과 산의 순차 침전에서는 28.5%의 추출 수율을, 에탄올 침전이 27.8%로 그 다음 높은 추출 수율을 보였고, 산 침전은 가장 낮은 추출 수율을 보였다(19.6%). 침전 방법을 조금 개선하여 에탄올 침전 후 잔여액에 다시 pH를 2로 낮추어 정치시키면 알긴산을 추가로 회수할 수 있어서 추출 수율을 조금 더 높일 수 있었다. 또한, 위 침전 방법에 따라 추출한 알긴산의 알긴산 분해효소(Flavobacterium sp. 유래 alginate lyase) 처리에 의한 저분자화 정도를 TLC로 확인한 결과에서(Fig. 1) 염화칼슘으로 침전한 알긴산의 분해도가 가장 낮게 나타났고, 에탄올 침전과 산 침전 시 알긴산의 분해정도가 높게 나타나 추출 수율이 높고 저분자화 반응에도 문제가 없는 에탄올 침전 방법을 최종 선택하였다.

Fig. 1.TLC analysis of alginate obtained by different sedimentation methods in which alginate was treated with or without alginate lyase. C, control(alginate oligosaccharides); lane 1, enzyme-treated alginate by CaCl2 sedimentation; lane 2, enzyme-treated alginate by acid sedimentation; lane 3, enzyme-treated alginate by ethanol sedimentation; lane 4, alginate by CaCl2 sedimentation; lane 5, alginate by acid sedimentation; lane 6, alginate by ethanol sedimentation; lane 7, enzyme-treated alginate (15 cp, 0.1%); lane 8, enzyme-treated alginate (15 cp, 0.5%).

추출 침전 방법에 따른 알긴산의 저분자화 정도

에탄올 침전과 산 침전, 염화칼슘 침전법으로 추출한 알긴산을 알긴산 분해효소(Flavobacterium sp. 유래 alginate lyase, 1 unit/ml)로 분해한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 염화칼슘 침전법으로 회수한 알긴산의 저분자화 반응 정도가 가장 낮게 나타났으며, 에탄올 침전법과 산 침전법의 알긴산이 disaccharide와 trisaccharide의 저분자화 정도가 가장 많이 나타나 저분자화 반응 정도가 높았지만, 두 침전방법으로 얻은 알긴산에 대한 각각의 저분자화 반응 정도는 크게 차이가 나타나지 않았다.

다시마 알긴산의 저분자화를 위한 alginate lyase의 최적 반응 조건

다시마 추출 알긴산의 농도를 3%와 5%로 준비하여 alginate lyase 1 unit/ml 과 효소 반응시킨 후, 저분자화 정도를 TLC로 분석하였다(Fig. 2). 5% 알긴산 농도로 반응한 경우 점도가 높고 반응액의 유동성이 낮아 반응하기에 부적합하였고, 3% 농도에 비해 저분자화 정도에 차이가 나타나지 않는 것으로 확인되어, 다시마 유래 알긴산의 저분자화 효소 반응시 초기 알긴산 농도는 3%로 결정하였다.

Fig. 2.TLC analysis of alginate degradation by 1 unit/ml alginate lyase with 3% (A) and 5% (B) alginate concentration. C, control (alginate oligosaccharides); Reaction time : lane 1, 0 min; lane 2, 10 min; lane 3, 30 min; lane 4, 1 hr; lane 5, 2 hr; lane 6, 3 hr.

저분자화 효소 반응 조건을 좀 더 확립하기 위하여 효소 농도와 반응 시간에 따른 저분자화 정도를 분석하였다(Fig. 3). TLC 분석 결과 알긴산 분해효소의 농도가 높을수록 저분자화 정도도 증가하는 것을 확인하였다. 하지만 알긴산 분해 효소를 5 unit/ml로 반응한 것과 10 unit/ml로 반응한 결과를 비교하였을 경우 저분자화 되는 정도에는 큰 차이가 없고, 경제적인 생산 비용을 고려하여 알긴산 분해효소를 5 unit/ml로 처리하는 것이 가장 적당한 것으로 결정하였다.

Fig. 3.TLC analysis of alginate degradation by alginate lyase with 5 unit/ml (A) and 10 unit/ml (B) in which the alginate concentration was 3%. C, control (alginate oligosaccharides); Reaction time : lane 1, 0 min; lane 2, 10 min; lane 3, 30 min; lane 4, 1 hr; lane 5, 2 hr; lane 6, 3 hr.

알긴산의 분자량 및 점도 측정

다시마 유래 알긴산의 저분자 반응 후 점도 변화를 측정하였다. 측정 결과 저분자 효소 반응 전 다시마 유래 알긴산의 점도는 40,000 cp 이상이었지만, 5 unit/ml 의 알긴산 분해효소 농도로 37℃에서 3시간 반응하여 저분자화한 알긴산의 점도는 4.5 cp 로 물과 비슷한 정도의 점도로 매우 낮아지는 것을 확인하였다.

알긴산의 분자량 변화는 알긴산 추출 가수분해의 온도가 높아짐에 따라 점차적으로 감소하고, 가수분해의 pH가 저하됨에 따라 급격히 감소한다. pH 0.5~2.5의 경우 50,000 Da이하의 분자량 분포는 pH가 저하됨에 따라 증가하였지만 분자량은 큰 변화가 나타나지 않았다[17, 18]. 저분자화 반응에 의한 알긴산의 분자량 변화는 알긴산 추출 침전 방법에 따라 분자량의 분포는 약간의 차이를 보여서 알칼리(Na2CO3) 추출법에서의 분자량(1,307,415 Da)과[15], 에탄올 침전법으로 얻은 알긴산의 분자량이 크게 나타났지만(1,970,000 Da), 식품첨가물로 시판(제주화학, 한국) 중인 알긴산 나트륨의 분자량(4,184,238 Da)보다는 낮게 나타났다. 산(염산 또는 구연산, pH 4.5) 또는 열(121℃, 30분) 가수분해법에 의한 저분자 알긴산의 분자량은 383~728 kDa, 점도는 3,940 cp 임에 비해[15, 17, 18], 본 연구에서의 알긴산 분해효소로 저분자화한 알긴산의 분자량은 307 kDa, 점도는 4.5 cp로 매우 낮아서 지방세포로의 흡수 등이 크게 향상되어 지방과립 형성과 중성지방 생성 억제 등에 효과적으로 작용할 것으로 추정된다.

저분자화 알긴산의 지방세포 분화 억제 효과

알긴산은 농도 의존적으로 3T3-L1 세포의 분화를 억제하고, triglyceride의 함량을 감소시키며, 3T3-L1 세포의 분화를 촉진시키는 인자로 밝혀진 insulin과 IGF-I (insulin-like growth factor-I)의 작용을 특이적으로 억제한다는 것이 알려져 있으나[7], alginate lyase 효소에 의해 생성된 저분자 알긴산의 3T3-L1 세포의 분화 억제에 대한 연구는 미흡하다. 따라서 본 실험에서는 다시마 알긴산의 저분자화물의 지방 세포 분화억제 효과를 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화할 때 저분자화 알긴산을 첨가하여 분화억제 정도를 확인하였다. 또한, 저분자화 알긴산을 농도별(125 μg/ml, 250 μg/ml)로 처리하여 배양한 지방세포와 저분자화 알긴산을 처리하지 않은 지방세포에서 생성된 지방 과립과 triglyceride의 함량을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다.

Fig. 4.Inhibitory effects of low-molecular-weight-alginate on the accumulation of lipid droplet (A) and triglyceride (B) in differentiated 3T3-L1 mouse preadipocytes.

Fig. 4A에서 볼 수 있듯이 다시마 유래 저분자화 된 알긴산을 처리하지 않았을 경우에는 세포질 내 중성지방의 형성이 관찰되었지만, 저분자화 알긴산을 처리하였을 경우에는 중성지방의 형성이 억제되는 것을 볼 수 있었다. 또한, 저분자화 알긴산 125 μg/ml 및 250 μg/ml 농도에서 대조군(무처리)과 비교하여 각각 33.7%와 44.4% 정도로 triglyceride 중성지방 축적이 감소됨을 확인하였다(Fig. 4B). 따라서, 저분자화 알긴산에서 지방세포 분화억제 효과가 있음을 확인하였다. 0.5% 알긴산에 의한 지방세포 내 triglyceride 축적 감소된 보고[7]와 비교하면, 본 연구에서는 약 2,000배 정도 낮은 저분자 알긴산 농도(250 μg/ml)에서 지방과립 생성과 triglyceride 축적 감소를 확인한 바, 저분자 알긴산의 지방세포 분화 억제 효과가 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 또한, 산가수분해에 의해 얻은 저분자 알긴산인 폴리만뉴로네이트(분자량 40 kDa)도 혈청내 triglyceride, 인지질, 총 콜레스테롤 등의 수치와 지방세포 및 쥐 혈청 내 leptin 발현량을 감소시키는 농도가 0.5%로 알려져[10,13], 본 연구에서의 저분자 알긴산(307 kDa, 4.5 cp)이 훨씬 낮은 농도(250 μg/ml)에서 효과적으로 지방세포의 분화를 억제시킴을 알 수 있었다. 결론적으로, 본 연구에서의 효소에 의한 저분자화 알긴산(polymannuronate)은 지방세포로의 흡수 등이 크게 향상되어 지방과립 형성과 중성지방(triglyceride 등) 생성 억제 등에 효과적으로 작용함으로써 지방세포의 분화 억제 효능을 발휘한 것으로 판단된다.

 

결 론

기장 지역 다시마로부터 알긴산의 효율적인 추출, 침전, 회수조건은 1% Na2CO3, 80℃, 에탄올 침전 회수법이였고, 알긴산 분해효소(Flavobacterium sp. 유래 alginate lyase)를 이용한 저분자화 효소 반응 시 최적 초기 알긴산 농도는 3%였다. 알긴산 분해효소 농도에 따른 알긴산의 저분자화 정도에는 큰 차이가 없고, 경제적인 생산 비용을 고려하면 최적의 알긴산 분해효소 농도는 5 unit/ml 였으며, 5 unit/ml의 알긴산 분해효소 농도로 37℃에서 3시간 반응하여 저분자화한 알긴산의 점도는 4.5 cp, 분자량은 307,008 Da 였다. 3T3-L1 지방전구세포에 저분자화 알긴산을 125 μg/ml, 250 μg/ml 농도로 처리하였을 때 지방과립 형성과 triglyceride 중성지방 축적이 감소됨을 확인하였다. 따라서, alginate lyase로 저분자화된 알긴산은 지방세포 분화억제 효과가 있음을 확인하였다.