Homology Modeling and Characterization of Oligoalginate Lyase from the Alginolytic Marine Bacterium Sphingomonas sp. Strain MJ-3

알긴산을 분해하는 해양미생물인 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 올리고알긴산 분해효소의 상동성 모델링 및 특성연구

Abstract

Alginates are found in marine brown seaweeds and in extracellular biofilms secreted by some bacteria. Previously, we reported an oligoalginate lyase from Sphingomonas sp. MJ-3 (MJ3-Oal) that had an exolytic activity and protein sequence homology with endolytic polymannuronate (polyM) lyase in the N-terminal region. In this study, the MJ3-Oal was tested for both exolytic and endolytic activity by homology modeling using the crystal structure of Alg17c from Saccharophagus degradans 2-40T. The tyrosine residue at the $426^{th}$ position, which possibly formed a hydrogen bond with the substrate, was mutated to phenylalanine. The FPLC profiles showed that MJ3-Oal degraded alginate quickly to monomers as a final product through the oligmers, whereas the Tyr426Phe mutant showed only exolytic alginate lyase activity. $^1H$-NMR spectra also showed that MJ3-Oal degraded the endoglycosidic bond of polyM and polyMG (polymannuronate-guluronate) blocks. These results indicate that oligoalginate lyase from Sphingomonas sp. MJ-3 probably catalyzes the degradation of both exo- and endo-glycosidic bonds of alginate.

알긴산은 미역이나 다시마 같은 갈조류의 세포벽에 존재하거나 또는 특정 박테리아들이 biofilm을 만들기 위하여 생산하는 L-${\alpha}$-guluronate 및 D-${\beta}$-mannuronate로 구성된 산성다당류이다. 전보에서 보고한 Sphingomonas sp. MJ-3의 외부 분해효소인 올리고알긴산 분해효소(oligoalginate lyase, MJ3-Oal)는 효소단백질의 N-terminal 영역에 내부 알긴산 분해효소인 polyM 분해효소의 단백질 서열과 상동성을 가지고 있었다. 본 실험에서는 MJ3-Oal이 외부 분해효소 활성뿐 만 아니라 내부 분해효소 활성도 함께 가지는 효소인지 알기 위하여 Saccharophagus degradans 2-40T 유래 올리고알긴산 분해효소인 Alg17c의 결정구조와 상동성 모델링을 행하였으며 기질과 수소결합을 할 것으로 예상되는 잔기 중 426번째 아미노산인 tyrosine을 구조가 비슷한 phenylalanine으로 돌연변이시키고 알긴산 분해양상을 wild type과 비교하였다. MJ3-Oal의 FPLC 결과를 보면 처음에는 이당류, 삼당류 등 올리고머가 증가하다가 최종적으로 단당류로 전환되었으나 Tyr426Phe 돌연변이 효소의 FPLC profile은 외부 분해활성만 나타내었다. 또한 $^1H$-NMR spectra 역시 MJ3-Oal은 polyM block 또는 polyMG block의 내부결합을 분해하는 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과들은 Sphingomonas sp. MJ-3 유래 올리고알긴산 분해효소는 외부 분해효소 활성 및 내부 분해효소 활성 모두 가질 가능성을 뒷받침해 준다.

서 론

미역, 다시마 및 모자반 같은 갈조류(brown seaweed, Phaeophyceae)에는 세포벽에 셀루로즈와 산성다당류인 알긴산 및 퓨코이단 등을 함유하고 있으며 그 중 알긴산은 갈조류 건조구성물의 14-37%를 차지한다[3, 9, 23]. 해조류 유래 알긴산은 β-D-mannuronate (M) 단량체들로 이루어진 polyM block (M-(β1-4)-M 결합), α-L-guluronate (G) 단량체들로 이루어진 polyB block (G-(α1-4)-G 결합) 및 M과 G로 이루어진 polyMG block 등으로 구성되어 있다. 알긴산 분해효소에 의하여 생성된 올리고알긴산은 산으로 가수분해하여 얻은 올리고알긴산보다 항암효과, 정장효과, 면역기능 향상 등의 생리활성이 높다고 보고되어 있다[1, 4, 7, 25]. 알긴산 분해효소는 다당류 분해효소(polysaccharide lyase, PL, EC 4.2.2.-)에 속하며 내부 알긴산 분해효소(endotype alginate lyase) 및 외부 알긴산 분해효소(exotype alginate lyase)가 있다. PolyM block, polyG block 및 polyMG block 등은 당 사이의 결합방식이 다르기 때문에 M-(β1-4)-M 결합을 분해하는 polyM 분해효소(EC 4.2.2.3), G-(α1-4)-G 결합을 분해하는 polyG 분해효소(EC 4.2.2.11) 및 M-(β1-4)-G 또는 G-(α1-4)-M 결합을 분해하는 polyMG 분해효소(EC 4.2.2.-) 등 내부 알긴산 분해효소들에 의하여 비환원말단 우론산의 C4와 C5 사이에 이중결합을 가지는 불포화우론산 올리고머들이 생성된다. 그러나 알긴산을 유일한 탄소원으로 하여 생존하는 알긴산분해 박테리아들은 내부 알긴산 분해효소들에 의하여 생성된 올리고머들을 단량체로 만들어야만 pyruvate나 glyceraldehydes-3-phosphate로 전환시켜 에너지원으로 이용할 수 있다. 따라서 알긴산분해 박테리아들은 내부 알긴산 분해효소 및 외부 알긴산 분해효소와 함께 알긴산 단량체를 전환시키는 효소의 유전자들을 가지고 있다고 보고되었다[11, 14, 17]. 본 연구실에서는 알긴산을 분해하여 이용하는 해양 박테리아 Sphingomonas sp. MJ-3 및 Stenotrophomonas maltophilia KJ-2 균주로부터 알긴산 분해에 관련된 유전자 operon을 Fig. 1과 같이 분석하였으며 아세틸알긴산 에스터레이즈(AcAlgE), polyMG 내부 분해효소(polyMG lyase) 및 올리고 알긴산 분해효소(oligoalginate lyase)에 대하여 보고한 바 있다[12, 18]. Momma 등[14] 및 Yamasaki 등[24]에 의하면 Sphingomonas sp. A1 균주는 여러 종류의 polyM 분해효소 및 polyG 분해효소들과 하나의 외부 알긴산 분해효소를 가지고 있다고 하였으며 agar, chitin, mannan, pectin 등 여러 종류의 다당류를 분해하는 것으로 알려진 Saccharophagus degradans 2-40T 균주는 여러 종류의 내부 알긴산 분해효소 및 외부 알긴산 분해효소를 가진다고 하였다[6, 21]. 본 연구실에서 분리한 Sphingomonas sp. MJ-3 및 Stenotrophomonas maltophilia KJ-2의 일부 유전자 operon을 보면 내부 알긴산 분해효소로는 polyMG 분해효소 만을 가지고 있었고 외부 알긴산 분해효소는 보고된 Sphingomonas sp. A1 및 Agrobacterium tumefaciens 유래 외부 알긴산 분해효소에 비하여 활성이 높았으므로 상동성 모델링을 통한 MJ-3 외부 알긴산 분해효소의 입체구조를 예측하고 NMR 분석 및 돌연변이를 통하여 효소 특성을 연구하였다.

Fig. 1.Analysis of alginate gene operon of alginate degrading marine bacterium, Sphingomonas sp. Strain MJ-3. P and TT mean common promoter and transcription terminator of this operon. PolyMG lyase, Mfs-1, KDG-dehydrogenase and AcAlgE indicate polyMG-specific alginate lyase, major facilitator superfamily including hexuronate transporter, 5-keto-4-deoxygluconate dehydrogenase and acetylalginate esterase, respectively.

 

재료 및 방법

효소 및 시약

본 실험에서 올리고알긴산 분해효소(Oligoalginate lyase, Oal) 를 돌연변이시키기 위하여 사용한 주형 DNA는 박 등[17]이 cloning한 Sphingomonas sp. MJ-3균주의 유전자(GenBank ID: JN091777)로 pET21b(+)/MJ3-Oal plasmid DNA 이었다. Ni-sepharose resin은 Amersham Biosciences (USA) 제품을, 탈염 column 및 FPLC column은 GE Healthcare (USA) 제품을 사용하였다. 기질로 사용한 소디움 알지네이트는 Sigma(USA) 제품을 사용하였으며 polyG, polyM 및 polyMG block은 Haug 등[5]의 방법에 따라 준비하였고 1H-NMR spectra 분석결과 mannuronate와 guluronate의 조성은 Table 1과 같았다.

Table 1.aDPn indicates the average degree of polymerization. bAlginate (cps=3,500) were degraded to a DPn= 30-40 by mild acid hydrolysis.

MJ3-Oal 단백질서열의 PSI-blast 및 상동성 모델링

Sphingomonas sp. MJ-3 균주로부터 얻은 올리고알긴산 분해효소 단백질의 3차원적 입체구조를 예측하기 위하여 먼저 PSI-blast (position-specific iterate blast)를 행하였으며 입체구조가 보고된 올리고알긴산 분해효소들의 활성자리가 보존되어 있는지 확인하였다. 그 중 가장 아미노산 서열의 상동성이 높은 올리고알긴산 분해효소를 선택하여 Swiss-Modeller [2]에서 상동성 모델링을 행하였다. 단백질 모델과 결정구조 주형과의 겹쳐보기 및 기질과 수소결합을 할 것으로 예상되는 아미노산 잔기의 표시, 활성에 영향을 미치는 아미노산 잔기등을 나타내기 위하여 Chimera program [19]을 이용하였다.

MJ3-Oal의 426번째 Tyrosine 잔기의 돌연변이

Signal peptide가 제거된 상태로 cloning된 pET21(b)/MJ3-Oal plasmid DNA를 주형으로 Stratagene 사(USA)의 site-directed mutagenesis kit를 사용하여 돌연변이시켰다. Forward primer로는 5′ - CAAGGATGGCGGGCGCTTCCTCAAGGAAAATGAGAG - 3′를, reverse primer로는 5′- CTCTCATTTTCCTTGAGGAAGCGCCCGCCATCCTTG-3′를 사용하여 MJ3-Oal 유전자의 426번째인 tyrosine 잔기를 phenylalanine 잔기로 대체하였다(Tyr426Phe). 염기서열 결정법으로 돌연변이된 것을 확인한 후 wild type과 함께 효소활성 시험에 사용하였다.

MJ3-Oal wild type 및 Tyr426Phe 단백질의 효소활성 측정

알긴산 분해효소들은 알긴산의 α(1-4) 또는 β(1-4) 당결합을 분해하여 비환원말단의 C-4와 C-5 사이에 이중결합을 만드는 β-제거반응 촉매효소들이다. 외부 알긴산 분해효소인 MJ3-Oal은 알긴산을 비환원말단부터 분해하여 enol형태의 불포화 우론산을 만들고 불안정한 enol형태는 비효소적으로 안정한 keto acid 형태인 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid로 비효소적 변환이 일어난다. 최종생성물인 불포화올리고당 또는 keto acid (monomer)의 함량을 측정하기 위하여 thiobarbituric acid 방법[22]을 하였으며 548 nm에서 측정하였다.

MJ3-Oal 효소의 과발현 및 단백질 정제

MJ3-Oal wild type 및 Tyr426Phe mutant 유전자를 함유한 재조합 대장균 BL21 (DE3)을 ampicillin이 50 μg/ml 함유된 LB배지에서 배양하고 IPTG로 단백질을 유도발현시킨 다음 이 등[12]의 방법에 따라 초음파 파쇄기로 파쇄하였다. Ni-sepharose 친화력 resin을 사용하여 과발현된 (His)6-tag 융합 단백질을 정제하였다. SDS-PAGE 및 immunoblotting을 이용하여 정제된 단백질을 확인한 다음 알긴산 분해실험에 사용하였다.

MJ3-Oal 효소로 분해한 알긴산 분해물의 분석

MJ3-Oal 효소로 분해한 알긴산 분해물을 측정하기 위하여 0.5% 소디움 알긴산 또는 5%올리고 알긴산과 20 mM 인산완 충용액(pH 7.0), 50 μg 효소액이 함유된 1 ml 반응액을 30℃에서 시간별로 반응시킨 다음 희석하여 FPLC로 분석하였다. Tyr426Phe 돌연변이 효소의 경우 활성이 낮았으므로 0.1% 소디움 알긴산 용액에 750 μg 효소액을 사용하였다. FPLC용 column인 Superdex peptide column 100/300 GL (GE Healthcare, USA)으로 분리하였으며 235 nm 자외선 검출기로 분석하였다.

MJ3-Oal 효소로 분해한 알긴산 최종 생성물의 1H-NMR spectra 분석을 위하여 이 등[12]의 방법에 따라 먼저 0.5% 기질 용액을 정제된 효소액으로 분해가 끝날 때까지 반응시킨 다음 동결건조하였다. 동결건조된 분해물을 D2O로 녹여서 다시 동결건조하고 D2O로 녹여 사용하였다. NMR 분석시 시료800 μl에 내부표준물질인 TMSP (0.75% 3-trimethylsilyl)- 2,2′,3,3′- tetradeuteropropionic acid, Na salt) 10 μl 씩을 가하여 잘 섞은 다음 측정하였다. 시간별 분해물의 NMR 측정을 위하여는 먼저 Ni-sepharose column으로 정제한 효소를 20mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 탈염한 다음 200 μg씩 여러개의 vial에 나누어 담고 동결건조한 다음 효소원으로 사용하였다. D2O로 녹인 1% 기질용액을 효소가 들어있는 vial에 800μl 넣고 30℃에서 반응시킨 다음 시간별로 반응을 끝내고 원심분리하여 NMR 시료로 하였다. Data 수집은 80℃에서 행하였으며 조건은 Kam 등[8]의 방법과 같았다.

 

결과 및 고찰

MJ3-Oal 단백질 서열의 상동성 및 입체구조예측

박 등[18]은 알긴산을 유일한 탄소원으로 사용하여 에너지원으로 사용하는 해양미생물 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 genome DNA library로부터 알긴산분해효소를 포함한 알긴산 operon을 분석하였으며 Fig. 1과 같았다. 박 등[17]은 알긴산 및 올리고알긴산을 불포화우론산 단량체로 분해하는 외부 알긴산분해효소인 MJ3-Oal (MJ-3 oligoalginate lyase) 유전자를 cloning하고 대장균에 형질전환시켜 단백질의 특성을 연구 보고하였다. Miyake 등[13]이 보고한 A1-IV (GenBank ID:BAB03319, momma) 및 Ochiai 등[15]이 보고한 Atu3025(GenBank ID: NP_357573) 등 다른 외부 알긴산분해효소들은 알긴산으로부터 단량체를 생성하는데 많은 시간이 걸렸으며 이는 고분자량인 알긴산을 비환원말단부터 하나씩 끊어내기 때문이라고 하였다. 그러나 박 등[17] 및 류 등[20]의 결과를 보면 보고된 A1-IV 및 Atu3025 효소와는 달리 고농도의 올리고알긴산 또는 고분자량 알긴산 용액을 짧은 시간에 단량체로 분해하였으며 단백질 서열을 분석한 결과 N-terminal region에 내부 알긴산분해효소인 polyM 분해효소들와 상동성서열을 가지고 있었다. 이는 MJ-3 균주가 가지는 외부 알긴산 분해효소 MJ3-Oal는 외부 분해효소 활성뿐 만 아니라 내부 분해효소활성도 가질 수 있음을 의심할 수 있었다. 그래서 MJ3-Oal 단백질 서열을 먼저 활성자리를 이루는 잔기들에 맞추어 서열 정렬(PSI-blast)을 행하였으며 결정구조가 알려진 단백질 중 제일 상동성이 있는 단백질인 Alg17c (GenBank ID: 4NEI)를 주형으로 선택하였다. 여러 종류의 당을 분해하는 효소들을 40여종 가지고 있는 Saccharophagus degradans 2-40으로부터 얻어진 외부 알긴산분해효소인 Alg17c 단백질 서열과 48.1% 동일성을 가졌으나 A1-IV와는 낮은 상동성을 나타냈었으므로 MJ3-Oal 단백질의 구조를 예측하기 위하여 기질인 삼량체와 Alg17c 단백질을 함께 결정화시킨 Tyr258Ala 변이체 결정구조(pdb code: 4OJZ)를 사용하였다. 4OJZ를 주형으로 하여 상동성 modeling을 행한 결과는 Fig. 2A와 같았으며 N-terminal region은 (α/α)6 helix구조, C-terminal region은 antiparallel β-sheet 구조를 가지는 PL17 family에 속함을 알 수 있었다. Fig. 2B-2D는 주형인 4OJZ 및 MJ3-Oal model의 활성자리 주변에 기질인 삼량체(ΔMMG, unsaturated mannuronate-mannuronate-guluronate)와 4Å 거리를 가지고 있어 수소결합을 할 수 있는 아미노산 잔기들 중 일부를 나타낸 것이다. 그려진 8가지 아미노산 잔기 중 4OJZ의 Lys136이 MJ3-Oal의 Ser112로 바뀌었을 뿐 다른 잔기들은 보존되어 있음을 볼 수 있다. Park 등[16]은 4OJZ 결정구조의 Lys136과 Lys198 잔기가 기질의 3번째 당인 L-guluronate와 수소결합을 할 거리에 있다고 하였으나 MJ3-Oal의 경우 Ser112와 Gln174로 대체되어 있었으며 Gln174의 경우 alanine으로 돌연변이시켰을 때 활성의 변화는 보이지 않았다(data not shown). Alg17c 단백질의 경우 C-terminal region의 His415, Asp433 및 His464잔기 측쇄가 Zn2+ 이온과 결합하고 있다고 하였으며 MJ3-Oal의 경우에도 His391, Asp409 및 His440 잔기로 잘 보존되어 있었다.

Fig. 2.Homology modeling of MJ-3 oligoalginate lyase based on crystal structure of exotype alginate lyase Alg17c from Saccharopphagus degradans 2-40. A: MJ3-Oal model and Alg17c (4OJZ.pdb) crystal structures from S. degradans were super-imposed by matching conserved residues. Substrate is shown as a molecular surface in the enzyme cleft between N-terminal α/α barrel domain and C-terminal antiparallel β-sheet domain. B: Active site of Alg17c protein. Represented amino acid residues were selected within 4Å from trisaccharide substrate. C: Superimposed active sites of Alg17c and MJ3-Oal model. D: Proposed active site of MJ3-Oal oligoalginate lyase. Substrate △M-M-G means unsaturated mannuronate-mannuronate-guluronate trisaccharide.

알긴산 분해효소로 분해한 알긴산 분해물의 1H-NMR 분석

이 등[12]이 보고한 내부 알긴산 분해효소인 polyM 분해효소, polyG 분해효소 및 polyMG 분해효소에 의한 알긴산 분해물의 NMR spectra는 Fig. 3과 같았다. 내부 분해효소는 고분자 알긴산 내부의 M-M 결합, G-G 결합 또는 M-G/G-M 결합을 분해하여 이량체, 삼량체, 사량체 등 비환원말단에 이중결합을 가지는 불포화 올리고당을 생성한다. 불포화 올리고당의 생성으로 6.0-5.7 ppm 및 5.2-5.3 ppm 에서의 peak가 나타났으며 환원말단 (Mred, Gred)이 많이 생성되어 4.8-4.9 ppm과 5.9ppm 근방의 peak가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 알긴산, polyM block, polyG block 및 polyMG block에 외부 알긴산 분해효소인 MJ3-Oal을 처리하여 완전 분해한 후 동결건조한 다음 NMR spectra를 측정한 결과는 Fig. 4와 같았다. 내부 분해효소를 처리하였을 때는 Fig. 3에서와 같이 불포화 올리고당의 peak들(6.0-5.7 ppm 및 5.2-5.3 ppm)을 관찰할 수 있었으나 외부 분해효소를 처리하였을 경우(Fig. 4)에는 불포화 올리고당의 peak들은 거의 찾아볼 수 없었고 기질들(알긴산, polyM, polyG 및 polyMG block)이 가지고 있으면서 signal을 나타내었던 G-1, G-5, M-1 등의 peak들이 사라지고 8.9ppm 및 7.2 ppm에서 새로운 peak가 나타났다. Miyake 등[13]과 Park 등[18]이 보고한 바와 같이 외부가수분해에 의하여 최종적으로 생성되는 물질은 C4와 C5사이에 이중결합이 생긴 pyranose 형태인 불포화우론산(4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronic acid)이지만 enol 형태이므로 불안정하여 비효소적인 tautomerism 전환으로 open form인 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid가 생성된다. 일반적으로 aldehydic proton은 9-10 ppm에서 carboxylic proton은 10.5-12ppm에서 chemical shift가 일어난다고 보고되어 있으나 aldehyde기와 carboxyl기를 가지는 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid의 NMR data에 대한 보고가 없어 비교할 수가 없었다. 그러나 최종 분해생성물의 MS/MS data에서 단량체의 분자량을 확인할 수 있었으므로 8.9 ppm 및 7.2 ppm의 peak들이 aldehyde기와 carboxyl기의 proton에서 유래한 signal일 것으로 생각하였다.

Fig. 3.1H-NMR spectra of alginate degradation products by three endolytic alginate lyases. PolyMG lyase, polyM lyase and polyG lyase were overexpressed proteins from Stenotrophomonas maltophilia KJ-2, Pseudomonas sp. strain KS-408 and Streptomyces sp. strain Alg-5, respectively. The signals originated from the underlined residues. The numbers denote proton causing the signal. M or G without underline indicates neighbor residue.

Fig. 4.1H-NMR spectra of substrate degradation products by MJ-3 oligoalginate lyase. The saccharide composition of alginate, polyMG block, polyM block and polyG block were at Table 1. Reaction mixtures after complete degradation were freeze-dried and dissolved with D2O. The signals originated from the underlined residues. The numbers denote proton causing the signal. M or G without underline indicates neighbor residue.

Fig. 5는 MJ3-Oal 효소를 동결건조하여 D2O로 녹인 다음 1% 알긴산용액을 넣어 시간별로 반응시켜 NMR로 분석한 결과이다. M-1-M peak가 제일 먼저 줄어들고 M-1-G 및 MG-5-M peak가 감소하는 것으로 보아 이 효소는 M-M 결합을 분해하는 활성이 높고 M-G 결합을 분해하는 활성은 M-M 결합분해활성에 비해 낮은 것을 알 수 있었다. 24시간이 지나도 GG-5G 및 G-1 peak가 남아 있는 것으로 보아 polyG block을 분해하는 활성은 아주 낮은 것을 알 수 있고 불포화올리고당들의 signal들도 시간이 갈수록 감소하였으므로 단량체의 생성을 예측할 수 있었다.

Fig. 5.1H-NMR spectra of time dependent alginate degradation products by MJ-3 oligoalginate lyase. Each 800 μl 1% alginate solution in D2O was added to lyophilized enzyme in each vial and incubated at 30℃. After incubation for indicated time, reaction mixture was boiled to remove the activity and moved into NMR tube. The signals originated from the underlined residues. The numbers denote proton causing the signal. M or G without underline indicates neighbor residue.

MJ3-Oal wild type과 Tyr426Phe mutant의 활성비교

MJ3-Oal 효소를 과발현시킨 재조합균주를 원심분리한 다음 라이소자임 용액으로 세포를 용균시킨 후 다시 원심분리하여 얻은 세포균질액을 효소액으로 사용하였다. 알긴산용액을 기질로 하여 효소액을 첨가한 다음 30℃에서 반응시키면서 시간에 따라 반응액의 TBA가를 측정한 결과는 Fig. 6와 같았다. MJ3-Oal Tyr426Phe 변이체의 분해활성은 wild type에 비하여 현저히 낮은 것을 알 수 있었다.

Fig. 6.Alginate lyase activities of MJ-3 oligoalginate lyase (wild type) and its mutant. Y426F means mutant whose tyrosine residue at 426th is replaced with phenylalanine. Cell lysate was added to 2 ml of 0.2% (w/v) alginate solution containing 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The reaction was conducted at 30℃. A 100 μl reaction mixture was time-dependently taken and assayed by TBA method.

MJ3-Oal wild type과 Tyr426Phe mutant의 알긴산 분해 특성

Sphingomonas sp. MJ-3 균주로부터 얻은 외부 올리고알긴산 분해효소가 내부 올리고알긴산 분해효소 활성도 함께 가지고 있는지 확인하기 위하여 wild type 효소와 Tyr426Phe 변이체의 알긴산 분해물을 FPLC로 분석하여 비교하였다. Fig. 7A-a에 사용한 기질은 Streptomyces sp. Alg-5 균주 유래 polyG 분해효소로 알긴산을 분해하여 얻은 올리고 알긴산 혼합물이며 BioGel P2 column으로 각 peak들을 분리하여 ESI-MS 질량분석기로 이량체, 삼량체 및 사량체 등이 있음을 확인하였다(0 hr) [10]. Fig. 7A-a 결과는 박 등 [18]이 보고한 것으로 5% 올리고 알긴산 혼합물에 정제된 MJ3-Oal wild type 효소 100 μg을 가하고 0.5 시간 반응 후 결과를 보면 삼량체와 사량체의 peak가 감소하였고 이량체의 peak는 거의 유지되고 있었으며 단량체의 peak가 나타나기 시작하였고 6시간 반응 후 삼량체 및 사량체는 거의 다 분해되고 단량체가 많이 생성되었으나 이량체는 아직 많은 양이 남아 있음을 볼 수 있었으며 30 시간 후 거의 단량체로 분해되었다. Fig. 7A-b에 사용한 기질은 고분자량인 소디움알긴산 0.5% 용액으로 이중결합이 없으므로 기질만의 FPLC 그림은 표시하지 않았다. 50 μg MJ3-Oal wild type을 가하여 반응시킨 다음 1분 후 분해물에는 단량체 보다도 이량체 함량이 더 많았고 삼량체 및 사량체들이 관찰되었다[21]. 반응 후 30분 분해물에는 올리고머들은 거의 단량체로 분해되었음을 볼 수 있었다. Fig. 6에서와 같이 Tyr426Ala 변이체는 알긴산 분해활성이 낮았으므로 0.1% 소디움알긴산 용액에 정제된 MJ3-Oal Tyr426Ala 변이체를 가하여 오랜 시간동안 분해하면서 시간별로 분해물을 분석한 결과는 Fig. 7B와 같았다. 1시간 후 불포화다당류(polymer)가 많이 남아 있으면서 수많은 올리고머들과 함께 단량체가 생성되기 시작하였다. 10시간 후 생성물의 FPLC 결과 역시 wild type 효소에 의한 분해물들(A-a 및 A-b)의 FPLC 결과와는 달리 이량체의 peak는 다른 올리고머 peak들과 같이 작았으며 단량체만 증가하는 것을 볼 수 있었으며 이는 Miyake 등[13] 및 Ochiai 등[15]이 보고한 Sphingomonas sp. A1의 A1-IV 및 A. tumefaciens C58의 Atu3025 와 같이 외부 알긴산 분해효소활성만을 가짐을 예측할 수 있었다. 48시간 및 96시간 반응에서는 아직 올리고머의 함량이 측정되었으며 120 시간 반응시킨 결과 거의 모든 다당류가 단당류로 분해되었다.

Fig. 7.FPLC chromatogram of alginate degradation products by wild type (A) and Y426F mutant (B) of MJ-3 oligoalginate lyase. A-a: Substrate was oligosaccharide mixture (0 hr) which was obtained by the reaction of alginate and polyG lyase from Streptomyces sp. Alg-5. 5% oligoalginate mixture was reacted with 100 μg purified MJ3-Oal wild type at 30℃ and diluted reaction mixture was injected. A-a and B: 0.5% and 0.1% sodium alginate solution were reacted with 50 μg purified MJ3-Oal wild type or 750 μg Y426F mutant, respectively. The vertical dot line in the chromatogram indicates the injection time. The elution volumes of unsaturated monomer, dimer, trimer, and tetramer are 17.9, 16.8, 15.8 and 15.0 ml, respectively. Undigested polymers were eluted at 7.4 ml void volume.

Fig. 7에 나타난 FPLC 결과를 종합해 볼 때 박 등[17]이 외부 알긴산 분해효소라고 보고한 Sphingomonas sp. MJ-3 올리고알긴산 분해효소는 외부 분해활성 뿐만 아니라 내부 분해활성을 함께 가지고 있음을 알 수 있으며 426번째 아미노산인 tyrosine을 phenylalanine으로 돌연변이시킨 효소는 내부 분해활성을 잃고 외부 분해활성만을 가진다고 말할 수 있다. 또한 Tyr426은 내부 당결합을 분해하는데 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기일 것으로 예측할 수 있었다.

위와 같은 결과들을 얻기 위하여 경성대학교 공동기기센터소속 1H-NMR 및 FPLC를 사용하였다.