Shewanella oneidensis PKA1008 유래 알긴산 분해 효소에 의해 제조된 알긴산 올리고당의 항염증 효과

Anti-Inflammatory Effect of Alginate Oligosaccharides Produced by an Alginate-Degrading Enzyme from Shewanella oneidensis PKA1008 on LPS-Induced RAW 264.7 Cells

Abstract

The anti-inflammatory effect of alginate oligosaccharides on LPS-induced RAW 264.7 cells was investigated at different time points (0-60 h). The alginate oligosaccharides were produced by an alginate-degrading enzyme from Shewanella oneidensis PKA1008. The alginate oligosaccharides decreased the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines [tumor necrosis factor-${\alpha}$, interleukin (IL)-$1{\beta}$, and IL-6] in a dose-dependent manner. The alginate oligosaccharides showed peak anti-inflammatory activity after 36 h of incubation; at that time point, reduced protein expression of NF-${\kappa}B$ p65, iNOS, and COX-2 was detected. Furthermore, the alginate oligosaccharide treatment reduced the formation of ear edema at 36 h compared to samples examined at 0 h when the oligosaccharides were administered at 50 and 250 mg/kg body weight, as well as dermal thickness and mast cell numbers in a histological analysis. These results suggest that alginate oligosaccharides are a promising anti-inflammatory agent.

서 론

해조류는 육상생물과는 다른 독특한 서식환경 조건으로 인하여 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있으며, 현재 해조류 유래 기능성 소재로부터 항종양(Lee et al., 1992), 항바이러스(Kim et al., 2010), 항혈액응고(Scot et al., 1987) 및 면역증강(Cho et al., 1990) 등의 연구가 활발히 이루어지고 있다(Kim et al., 2011). 이러한 해조류 중의 대표적인 기능성 물질로 세포벽을 구성하는 점질 다당류인 알긴산, 푸코이단, 한천 및 카라기난 등이 있다. 그 중 갈조류의 세포벽 구성 점질 다당류인 알긴산은 β-D-mannuronic acid (M)와 α-L-guluronic acid (G)가 1,4-glycoside결합으로 노르말 사슬분자를 이루고 존재하고 있으며, 해조류의 종류, 계절 및 조체의 부위에 따라 M과 G의 구성 비율이 달라지고, 결합 순서 및 구조에 따라, 겔 형성능, 흡착능, 점도 등의 물리적 특징이 변하는 것으로 알려져 있다(Horn et al., 1999; Moen et al., 1999; Zvyagintseva et al., 2005).

이와 같은 다양한 기능성이 알려진 알긴산의 이용을 확대하기 위해 식품, 화장품 및 의료용 소재 측면에서 많은 연구가 진행되고 있지만, 상온에서 용해시간이 길고, 알코올류 함유 용매에는 난용이며, 농도가 높아짐에 따라 고점도 특성을 보이는 단점으로 인하여 산업적으로 이용하기에 제한이 따르고 있다(Cho et al., 2003). 이러한 단점을 보완하고 활용성을 높이기 위해 알긴산을 저분자화시켜 올리고당으로 제조함으로써 고점도의 문제를 해결하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(Lee et al., 1996; Lee et al., 1993). 이러한 방법에는 물리화학적 및 효소적 가수분해 방법이 있으며, 물리화학적 분해방법인 고온고압(Kim et al., 2010), 방사선 처리(Song et al., 2008), 산 및 알칼리 처리(Lee et al., 1975) 방법이 있다. 물리화학적 처리방법은 처리시간이 짧고 간단하지만, 산 또는 알칼리처리를 통해 생성되는 독성 부산물의 작용 및 중화 시 발생하는 염 등에 의해 영향을 받을 수 있으며, 정제가 어렵다는 단점이 있다. 반면, 효소적 가수분해 방법은 물리화학적 방법에 비하여 비용이 비싸지만 목적으로 하는 올리고당 생성에 유리하며 다른 부산물의 생성을 줄일 수 있는 장점이 있다. 따라서 알긴산의 효소적 가수분해를 통한 올리고당이 최근 산업적으로 자주 이용(Uo et al., 2006)되고 있으며, 고점도 문제의 해결뿐만 아니라 항산화(Bark et al., 2015), 항염증(Iwamoto et al., 2003) 등의 기능성 증진에 관한 연구가 보고되고 있다.

염증반응은 물리적, 화학적 자극에 의해 손상된 부위를 회복시키는 생체 방어 기작 중의 하나를 말하며 매개인자의 활성화에 따라 열, 부종, 홍반 등의 질병반응을 유발한다(Zamora et al., 2000). 대식세포(macrophage)는 lipopolysaccharide (LPS)의 자극에 의하여 활성화되어 nitric oxide (NO), interleukin-6(IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 IL-1β 등의 염증 매개 cytokine을 생성하여 염증반응에 관여하게 된다(Higuchi et al., 1990). 이러한 염증 매개 물질들의 형성은 arachidonic acid가 cyclooxygenase (COX)의 작용을 거쳐 leukotriene, thromboxane, prostaglandin 등으로 바뀌는 과정 및 NO의 대량 생성에 관여하여 염증매개에 역할을 하며, 숙주에 치명적인 결과를 초래한다고 알려져 있다(Jeong et al., 2014). 이와 같은 NO 및 염증 매개 cytokine은 염증반응과 밀접하게 연결되어 있으며, 이들의 생성을 억제하고 조절할 수 있는 물질은 염증 질환의 치료제 및 예방제로서 활용될 수 있다(Cho et al., 2012). 지금까지 염증 질환 치료제로서 주로 사용된 스테로이드 및 비스테로이드성 항염증제는 부작용 발생 우려로 인하여 장기간 사용이 어려워 이를 대체하기 위한 천연물 유래 항염증제의 개발이 많이 이루어지고 있는 실정이다(Kang et al., 2014).

이에 본 연구에서는 갈조류의 세포벽 점질 다당류이며 많은 기능성이 알려진 알긴산을 이전 연구에서(Sunwoo et al., 2013) 보고된 알긴산 분해능이 높은 Shewanella oneidensis PKA1008 유래 조효소와 반응시켜 생성된 알긴산 올리고당의 항염증 활성을 확인하고 산업적 이용가능성에 대하여 알아보고자 한다.

 

재료 및 방법

시험균주

본 실험에서 사용한 균주는 부산 연안 송정 앞바다에서 사멸기에 접어들어 분해가 진행 중인 녹조류 구멍갈파래(Ulva pertusa)를 채집하여 이로부터 획득한 알긴산 분해능이 뛰어난 S. oneidensis PKA1008 균주를 이용하였다(Sunwoo et al., 2013).

조효소액 제조

조효소액은 S. oneidensis PKA1008를 marine broth (Difco, Sparks, MD, USA) 배지를 이용하여 30℃에서 24시간 배양 후, 원심분리기(Supra 30K, Hanil Sciecne Co., Korea)를 이용하여 4℃에서 10,000 g로 30분간 원심 분리하여 상층액으로 하였다.

알긴산 올리고당 제조

알긴산(7%)과 조효소액을 1:1 (w/v)로 12 h 간격으로 0-60 h 동안 반응시켰다. 각 시간별로 반응이 끝난 후, 95-100℃ 끊는 물에서 10분간 반응시켜 효소를 불활성화 시켰다. 그런 다음, 10,000 g, 10 min, 4℃에서 원심분리하여 단백질을 침전시켜 제거한 후 상층액을 알긴산 올리고당으로 이용하였으며, 동결건조 후 −20℃에서 보관하며 사용하였다. 반응 시간별 알긴산 올리고당으로의 분해 정도는 thin-layer chromatography(TLC)를 이용하여 확인하였으며, silica gel F254 plate를 이용하여 sample 3 μL씩을 spotting하고 1-butanol:acetic acid:water(2:1:1 v/v/v) 전개액을 이용하여 전개한 다음 silica gel plate에 10% 황산첨가 에탄올 용액을 분무한 후 110℃에서 20분간 가열하였다. Standard mixture는 cellooligosaccharide를 사용하였으며, cellobiose, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose, cellohexaose는 Megazyme (Megazyme Co., Wicklow, Ireland) 및 glucose는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

세포배양

Murine의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB 40071)에서 분양받아 사용하였으며, DMEM에 10% inactivated fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 배지를 배양액으로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 실험과정의 모든 세포는 80-90% 정도의 밀도로 자랐을 때 계대 배양하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.

실험동물

마우스 귀 조직 관찰 실험에서 생후 8주령의 수컷, ICR 마우스를 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 구입하여 사용하였으며 마우스는 온도 20±2℃, 습도 50±10%, 12 h 명암주기가 유지되는 동물 사육실에서 1주일간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 부경대학교 동물실험윤리위원회로부터 동물실험 승인을 받아 수행하였다(승인번호 2014-01)

세포 독성 측정

시료의 세포독성을 평가하기 위해 Park et al. (2006)의 방법을 약간 변형하여 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.7 cell을 1×106 cells/mL 농도로 well plate에 분주하고 20 h 전 배양 후, 1 μg/mL의 LPS와 알긴산 올리고당(10, 50, 100 μg/mL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 22 h 본 배양하였다. 배양 후 5 mg/mL MTT (thiazol blue tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액을 첨가하고 2 h 재 배양하였다. 이를 4℃, 879 g에서 10분간 원심분리(UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea)하여 상층액을 제거하였다. 그 후, 각 well에 DMSO를 첨가하고 이를 microplate reader(Model 550, Bio-rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도[optical density (O.D.)]를 측정하였다. 세포증식능은 다음 식에 의해 계산하였다.

Proliferation index (%) = (sample O.D./ control O.D.) × 100

Nitric oxide 생성량 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess 반응을 이용하여 측정하였다(Lee et al., 2000). RAW 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 2.5×105 cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 5% CO2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 20 h 전 배양하였다. 세포에 1 μg/mL의 LPS와 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 알긴산 올리고당을 각각 처리하여 24 h 재 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후, 동량의 griess 시약(1% sulfanilamide + 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시키고, microplate reader (Model 550, Bio-rad)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.

염증 관련 cytokines 분비량 측정

염증 관련 cytokine의 분비량을 측정하기 위해 RAW 264.7 cell을 DMEM 배지를 이용하여 2.5×105 cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 5% CO2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 18 h 전배양한 후, 1 μg/mL의 LPS와 10, 50, 100 μg/mL의 알긴산 올리고당을 처리하여 12 h 재배양하였다. 세포배양액 내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine의 분비량을 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 이를 위해 ELISA microplate에 capture antibody로 anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β를 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 coating시켰다. 이를 0.05% Tween 20이 포함된 PBST로 세척하고 10% FBS 용액으로 blocking 하였다. PBST로 세척한 뒤, 각 microplate에 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2 h 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 뒤 희석한 biotinylated anti-mouse TNF-α, IL-6 detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 실온에서 1 h 반응시켰다. IL-1β의 경우, biotinylated anti-mouse IL-1β detection antibody를 첨가하고 1 h 반응 후, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30분 반응 시켰다. 그 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD 용액을 첨가하여 실온에서 30분 동안 암반응시켰다. 2 N H2SO4로 반응을 종료시킨 후, microplate reader (Model 550, Bio-rad)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

iNOS, COX-2 및 NF-κB 발현량 측정

알긴산 올리고당이 세포질 내 생성되는 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포를 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 후, Sheeba and Asha (2009)의 방법에 따라 iNOS 및 COX-2의 경우 cytosol lysis buffer [50 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg/mL aprotinin, 1% Triton X-100, 0.1% NP-40을 이용하였으며, NF-κB의 경우 nucleus lysis buffer (10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM ditiotreitol)를 첨가하여 30분간 4℃에서 lysis 시킨 후 15,520 g에서 20분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질을 정량하였으며, 30 μL의 lysate를 Laemmli (1970)의 방법을 사용하여 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 Towbin et al. (1979)의 방법을 참고하여 polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad)에 1시간 동안 전사시켜 5% skim milk가 포함된 tris buffered saline (TBSS, pH 7.5) 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking 하였다. iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현량을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2 및 NF-κB를 사용하여 1:500으로 희석하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBSS로 3회 세정하였다. 2차 항체로 horseradish peroxidase가 결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 다음 TBSS로 3회 세정하여 ECL 기질과 1-3분간 반응 후 각각의 단백질 밴드는 Gene tool (GeneGnome5, Syngene, Cambridge, UK)을 이용하여 가시화하였다.

귀부종 측정 및 조직 관찰

알긴산 올리고당의 항염증 효과를 in vivo 상에서 알아보기 위하여 Kim et al. (2002)과 Saraiva et al. (2011)의 방법에 의거하여 귀부종 억제율을 측정하고 조직 관찰을 실시하였다. 생후 8주령의 수컷, ICR 마우스에 알긴산 0 h, 알긴산 올리고당(36 h) 시료를 10, 50 및 250 mg/kg·body weight 농도로 200 μL씩 경구투여하고 한 시간 후 오른쪽 귀에 2.5% croton oil을 20 μL/ear 농도로 도포하였다. 도포 5시간 후 귀 두께를 측정하였고 croton oil의 처리로 귀 두께가 증가한 것을 부종의 형성으로 간주하였다. 귀 조직 관찰은 ICR 마우스의 오른쪽 귀에 샘플을 100 mg/mL 농도로 20 μL씩 도포하고 15분 뒤, 5% croton oil을 20 μL씩 도포하였다. 6시간 뒤, diethylether로 마취사 시키고, 귀 조직을 절제하여 10% formaldehyde에 72 h 고정하였다. 고정 후 파라핀 블록을 만들어 박편을 제조하고 hematoxylineosin (H&E) 및 toluidine-blue (T&B) 염색을 하여 조직을 관찰하였다.

Edema formation (%) = Sample의 귀 두께 / Control의 귀 두께 × 100

통계처리

실험 결과의 통계처리는 SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 평균값을 분산분석한 후, Duncan의 다중검정법으로 P<0.05 수준에서 항목들 간의 유의적 차이를 검정하였다.

 

결과 및 고찰

반응시간에 따른 조효소에 의한 알긴산 분해 정도

S. oneidensis PKA1008 균주가 생산하는 조효소액을 알긴산에 처리하였을 시 알긴산이 분해되어 올리고당이 생성되는지를 확인하기 위하여 TLC 분석을 실시하였다. 0-60 h 까지 분해 정도를 살펴본 결과(Fig. 1), 알긴산과 조효소액 반응 12시간 까지는 알긴산이 분해되지 않았으나, 반응 24 h부터 분해가 진행되어 36 h 까지는 trisaccharide와 pentasaccharide로 분해되었으며, 반응 48 h 이후부터는 monosaccharide까지 분해됨을 확인하였다. 따라서 S. oneidensis PKA 1008이 생산하는 조효소액은 알긴산을 단당 및 올리고당으로 분해시키는 것을 확인하였으며, 각 시간별 시료들을 이용하여 항염증 효과를 측정하였다.

Fig. 1.TLC analysis of alginate oligosaccharides obtained from crude alginate degrading enzyme in S. oneidensis PKA 1008 with various incubation time. Reaction time : lane 1, standard; lane 2. 0 h; lane 3, 12 h; lane 4, 24 h; lane 5, 36 h; lane 6, 48 h, lane 7, 60 h. Standard mixture of monomer glucose, dimer cellubiose, trimer cellotriose, tetramer cellotetraose, pentamer cellopentaose, and hexamer cellohexaose.

세포독성 측정

0-60 h 동안 분해시킨 알긴산 올리고당을 대식세포에 대한 세포독성을 알아보고 항염증 효과 실험을 위한 농도 조건 설정을 위하여 RAW 264.7 세포에 대해 MTT assay를 실시하였다. 시료를 10, 50 및 100 μg/mL 농도로 첨가하여 실험한 결과(Fig. 2), RAW 264.7 세포의 증식능이 모든 처리 농도에서 PBS 처리구와 유의적인 차이를 보이지 않아 세포 독성을 가지지 않음을 확인하였다. 따라서 이후의 RAW 264.7 세포를 이용한 항염증 효과 실험은 10, 50 및 100 μg/mL의 농도로 처리하여 실험을 진행하였다.

Fig. 2.Effect of alginate (0 h) and alginate oligosaccharides (12, 24, 36, 48, and 60 h) on the proliferation of RAW 264.7 cells. Cells were incubated in the presence of samples (10, 50, and 100 μg/mL) for 24 h. Cell proliferation was determined by MTT assay. Proliferation index (%) = (sample O.D./ control O.D.)×100. ND: not significantly different. Data represent the mean ± S.D. from three experiments.

Nitric Oxide 생성량 측정

NO는 인체 내 생리적이나 병적인 반응에서 중요한 물질로서 체내 염증 반응 시 대식세포와 같은 면역세포에서 iNOS에 의해 ʟ-arginine이 ʟ-citrulline으로 전환되는 과정에서 주로 생성된다(Lee et al., 2006). 적절한 수준에서는 혈소판억제, 면역조절, 신경전달, 혈관확장 등의 역할을 하지만 과도한 NO의 증가는 peroxynitrite, nitrogen dioxide와 같은 유해물질을 생성하여 면역질환을 포함한 관절염, 기관지염, 다발성 경화증과 같은 병적 반응을 일으킨다(Jeong et al., 2012; Kim et al., 2012). 또한 미토콘드리아로부터 cytochrome C, apoptosis inducing factor를 방출시켜 세포자연사를 일으키기도 한다(Hippeli and Elastner, 1999). 0-60 h 동안 분해시킨 알긴산 올리고당 처리에 의한 NO 생성 억제 효과를 살펴보기 위하여 RAW 264.7 세포를 LPS로 활성화 시켰다. 그 후 알긴산 올리고당 시료를 10, 50 및 100 μg/mL 농도로 처리하여 생성된 NO를 griess 시약을 이용하여 측정하였다(Fig. 3). PBS 처리구에서는 5.88±0.13 μM로 낮은 분비를 보였으나, LPS 자극에 의해 55.31±1.22 μM로 분비량이 약 10배 증가하였다. 반응 시간별 NO 분비량은 24 h 처리 이후에, 50-100 μg/mL 농도에서 알긴산 (0 h) 시료와 비교 시 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 36 h 반응시킨 알긴산 올리고당 시료가 100 μg/mL 농도에서 30.93±0.88 μM의 분비량을 보이며 LPS 단독 처리구에 비해 44% 억제율을 나타내 가장 높은 NO 분비 억제 효과를 가지는 것을 확인하였다. 이는 24 h 이후 알긴산이 trisaccharide와 pentasaccharide로, 48시간 이후부터 monosaccharide로 알긴산 올리고당화에 따른 NO 생성 억제효과로 사료된다. 이와 유사한 결과로 Yang et al. (2010)은 키토산 유래 올리고당이 NO 분비를 농도의존적으로 감소시켰으며, 분자량이 작을때 보다 분자량이 더 높은 경우에 조금 더 NO 분비를 억제시켰다고 보고하였다.

Fig. 3.Inhibitory effect of alginate (0 h) and alginate oligosaccharides (12, 24, 36, 48, and 60 h) on the production of nitric oxide in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated in the presence of LPS (1 μg/mL) alone or in combination with samples (10, 50, and 100 μg/mL) for 24 h. The culture media of the treated cells were used to measure NO levels. Means with different letters (a-d : 10 μg/mL, A-F : 50 μg/mL, a-g : 100 μg/mL) above the bars are significantly different (P<0.05).

염증 관련 cytokines 분비량 측정

대식세포는 LPS와 같은 항원의 자극을 받아 활성화 되면 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 등의 분비를 촉진하여 면역반응을 조절한다. IL-1β는 국소 염증반응을 매개하며, 종양괴사인자인 TNF-α는 종양세포를 파괴시키는 물질로 잘 알려져 있다(Dinarello et al., 1990; Stankiewicz et al., 2002). 또한, IL-6는 T세포의 활성화 및 염증매개물질의 발현을 통해 후천성 면역을 개시하는 물질이다(Liu et al., 1998). 따라서 본 연구에서는, 알긴산 올리고당화 시료의 염증성 cytokine의 분비에 대한 억제효과를 살펴보았다. 분비량을 측정한 결과(Fig. 4), 시료를 10, 50 및 100 μg/mL 농도로 처리 시 농도의존적으로 각각의 cytokine의 분비가 유의적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-α의 경우 0-60 h 샘플이 10-50 μg/mL 농도에서는 분비 억제에 큰 효과가 없었으나, 12-36 h 시료가 100 μg/mL 농도에서 LPS 단독 처리구와 비교 시 약 30% 정도로 분비 억제 효과가 가장 크게 나타났다. IL-1β의 경우에는 0 및 12 h 시료에서는 분비 억제 효과가 크지 않았으나, 24 h 이후부터 분비 감소에 효과를 보이는 것으로 나타났다. 100 μg/mL 농도에서는 24-60 h 샘플이 유의적인 차이가 없었으나, 36 h 시료가 10 및 50 μg/mL 농도에서 다른 시료에 비해 분비 억제 효과가 가장 좋았으며, 약 30% 및 40% 정도의 분비 감소 효과를 나타냈다. IL-6의 경우 LPS 단독 처리 시 557.52±18.48 pg/mL으로 분비량이 증가하였고, 모든 시료 처리에 의해 분비 감소 효과를 나타내었지만, 24-60 h 처리 시 분비량 억제에 더 효과를 나타내었으며, 특히, 48-60 h 시료가 100 μg/mL 농도에서 약 60% 정도의 감소 효과를 나타내었다. Yoon et al. (2007)은 키토산 올리고당이 TNF-a와 IL-6의 분비량을 효과적으로 감소시켰다고 보고하였다. Yang et al. (2010)의 연구에서는 키토산 올리고당의 분자량별 항염증 효과에 대해 측정한 결과, IL-1β 분비량 감소에 효과가 있었지만, 분비량 감소 효과가 분자량이 작은 경우(1-3 kDa)에는 분비 억제에 효과가 없었다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 이상의 결과, 조효소와 알긴산을 시간별로 반응시킨 결과, 36 h 시료에서 가장 좋은 항염증 효과를 나타냄을 확인하였다.

Fig. 4.Inhibitory effect of alginate (0 h) and alginate oligosaccharides (12, 24, 36, 48, and 60 h) on the TNF-α, IL-1β, and IL-6 in RAW 264.7 cells. Cells were incubated in the presence of LPS (1 μg/mL) alone or in combination with samples (10, 50, and 100 μg/mL) for 12 h. Culture supernatants were then isolated and analyzed using ELISA kit for cytokines. Means with different letters (a-e : 10 μg/mL, A-E : 50 μg/mL, a-e : 100 μg/mL) above the bars are significantly different (P<0.05).

iNOS, COX-2 발현에 미치는 영향

iNOS는 세포내 존재하지 않으나 외부자극에 의해 유도된 iNOS는 장시간 다량의 NO 분비를 촉진하며, 조직의 손상, 혈관투과성, 부종 등의 염증반응을 유발하는 염증매개성 물질들의 과잉 생산에 큰 영향을 미친다(Guha and Mackman, 2001). 또한 COX-2는 cytokine, 자외선, 세균성 내독소 등에 의해 과발현 되어 각종 퇴행성 질환의 발병과 진행에 영향을 미치며, 특히 체내에 발생되는 prostaglandin E2 (PGE2) 등의 염증인자 등과 관련되어 염증반응을 촉진한다(Chun and Surh, 2004). 따라서 알긴산 올리고당화 시료가 세포질 내에서의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 western blot 방법을 시행하였다(Fig. 5). 앞선 NO 와 pro-inflammatory cytokine의 분비 억제 결과에서 36 h 시료가 가장 좋은 항염증 효과를 나타내어 iNOS 및 COX-2의 발현 변화를 알아보았다. 그 결과, RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/mL) 처리하였을 경우 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현이 증가하였고 알긴산 올리고당화 시료 10 μg/mL에서는 발현의 변화가 거의 없었지만, 50 μg/mL 및 100 μg/mL에서 억제되는 것을 확인 하였다. 이는 36 h 시료에 의한 NO 분비 억제가 iNOS 활성 저해에 의한 것임을 확인하였고, 또한 COX-2의 발현도 저해됨을 확인하여 COX-2에 의한 염증 조절에도 효과를 나타낼 것으로 사료된다.

Fig. 5.Effect of alginate oligosaccharide (36 h) on LPS-induced iNOS, COX-2, and NF-κB p65 expression in RAW 246.7 cells. The levels of iNOS, COX-2 in the cytosolic protein and the p65 subunit of NF-κB in nuclear protein were determined by a western blot analysis. RAW 264.7 cells were treated with the indicated concentrations of alginate oligosaccharide (10, 50, and 100 μg/mL) and LPS (1 μg/mL) for 18 h or 30 min and the proteins were detected using specific antibodies. Means with different letters above the bars are significantly different (P<0.05).

NF-κB p65 활성화에 미치는 영향

LPS, TNF-α 또는 외부자극에 의해 활성화된 NF-κB p65는 세포 핵 내로 이동되어 전사조절 인자로서 작용하면서 iNOS 및 COX-2의 발현을 조절하며 염증 매개물질들의 과잉 생산에 중요한 신호전달 경로로서 알려져 있다. 따라서 NF-κB p65의 활성화를 억제시켜 핵으로의 이동을 억제하는 물질은 만성적인 염증으로 인한 질병에 대해 치료제로 이용되고 있다(Tak and Firestein, 2001). 본 연구에서는 항염증 효과가 가장 뛰어난 36 h 처리 알긴산 올리고당 시료가 NF-κB p65 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 western blot을 통해 단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과(Fig. 5), 처리 농도에 따라 NF-κB p65의 단백질 발현량이 감소함을 나타내었으며, 50 μg/mL 농도 이상에서는 40% 이상으로 감소하였다. 이를 통해 핵 내로 NF-κB p65의 이동이 억제되었음을 확인할 수 있었다. 위의 결과로 미루어보아, 알긴산 올리고당 시료가 LPS로 유도된 대식세포에서 활성화된 NF-κB signaling을 저해하고 전사인자로부터 증가되는 다양한 염증매개물들의 단백질 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 보인 것으로 생각된다.

귀 부종 억제 효과 및 조직 관찰

마우스 모델에서의 염증억제효과를 알아보기 위해 알긴산 0 h 및 36 h 알긴산 올리고당 시료를 10, 50 및 250 mg/kg 농도로 200 μL씩 경구 투여한 후 croton oil로 염증을 유발하였다. Croton oil은 피부에 도포하면 즉각적으로 강한 급성 염증반응을 유도하는데 이를 이용한 귀부종 실험은 급성염증에 대한 시료의 항염증 효과를 살펴보기 위한 대표적인 실험모델이다(Towbin et al., 1995). 본 연구에서는 시료의 귀 부종 억제 효과를 비교하기 위하여 시판 항염증제인 prednisolone을 사용하였으며, 이는 corticosteroid 합성 항염증제로 croton oil 유도 염증 반응을 효과적으로 억제한다고 알려져 있다(Tak and Firestein, 2001). Croton oil을 도포한 오른쪽 귀의 두께 차이를 비교하여 염증 유발의 억제 활성을 확인한 결과(Fig. 6), 0 h 및 36 h 시료는 농도의존적으로 감소효과를 보였으며, 10 mg/kg bw 농도에서는 유의적인 차이가 없었으나 50 및 100 mg/kg bw 농도에서는 36 h이 0 h보다 부종 억제에 효과가 더 좋았다. 특히, 36 h 올리고당 시료를 250 mg/kg body weight로 처리 시 positive control 50 mg/kg 농도로 경구 투여했을 때와 유사한 정도의 귀 부종 억제 효과를 나타내었다. 이를 통해 0 h 시료보다 36 h 알긴산 올리고당 시료가 염증 반응을 보다 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한 조직 관찰 결과에서(Fig. 7), croton oil로 부종을 유발한 마우스 귀 조직에 0 h 및 36 h 시료를 처리하였을 때 prednisolone 처리구와 유사한 정도로 진피 두께가 감소 하였으며, 진피에서의 침윤된 mast cell의 수도 가장 적은 것으로 나타났다. 이상으로, trisaccharide와 pentasaccharide로 저분자화된 알긴산 올리고당 시료가 고분자량인 알긴산에 비해 항염증 효과가 더 뛰어남을 확인하여, S. oneidensis PKA1008 유래 알긴산 분해효소는 알긴산의 고점도 문제 해결과 함께 알긴산 올리고당의 항염증 활성도 증진시켜 산업적으로 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.

Fig. 6.Inhibition of alginate (0 h) and alginate oligosaccharide (36 h) against croton oil-induced mouse ear edema. Means with different letters above the bars are significantly different (P<0.05).

Fig. 7.Photomicrograph of transverse sections of mice ears sensitized with topical application of croton oil 5% (v/v) in acetone or vehicle acetone stained with hematoxylin-eosin and toluidine-blue examined under light microscopy (magnification: ×200). Treatments: vehicle 2% Tween 80, prednisolone 0.08 mg/ear, 0 h sample 20 μL/ear, and 36 h sample 20 μL/ear. The numbers 1 and 2 indicate dermis and epidermis, respectively. The arrow indicates mast cell.