보양환오탕(補陽還五湯) 경구투여 후 면역 활성화에 의한 암 전이 억제 효과

Anti-metastatic Effect on Cancer cell and Immune System Activation by Orally Administered Boyanghwano-tang

Abstract

Objectives: This study was designed to investigate intestinal immune system activation and anti-metastatic effect on cancer cells by orally administered extracts of Boyanghwano-tang. Methods: To observe immunomodulating effects of Boyanghwano-tang on Peyer's patch cells, we measured cytokines GM-CSF, IL-4. In addition to observing effects of Boyanghwano-tang on hematopoiesis, we measured proliferation of bone marrow cells mediated by Peyer's patch cells in vitro. IgA induction activated in intestinal content and serum was measured to observe the effect of orally administered Boyanghwano-tang on mucosal immune system. After administering ovalbumin (OVA) with Boyanghwano-tang, Proliferation of Peyer's patch cell was measured to investigate gut immunostimulatory effect. Anti-metastatic experiments were conducted in vivo mouse model by using colon 26-M3.1 carcinoma cell. Results: The amounts of GM-CSF and IL-4 in the culture supernatant of Peyer's patch cells were significantly increased compared to the control group. The proliferation of bone marrow cell was significantly up-regualted with Boyanghwano-tang. These results indicate that oral administration of Boyanghwano-tang enhances the secretion of hematopoietic growth factors such as GM-CSF and IL-4 from Peyer's patch cells, and these cytokines also act on modulator of bone marrow cell proliferation. After orally administering OVA with Boyanghwano-tang, IgA induction and Proliferation of peyer's patch cell was up-regulated with Boyanghwano-tang. These results means orally administered Boyanghwano-tang activates intestinal immune system and has an inhibitory effect on tumor metastasis. In addition, We found that orally administered Boyanghwano-tang significantly inhibited tumor metastasis in vivo. Conclusions: Orally administered Boyanghwano-tang appears to have considerable activity on the anti-metastasis by activation of immune system.

Ⅰ. 서 론

오늘날 산업사회로의 전환에 따른 생활양식과 환경의 변화로 인하여 국민 건강을 저해하는 주요 질환은 각종 난치병이 주종을 이루고 있다1). 특히, 악성종양이라 일컫는 암은 발생 원인과 기전이 명백히 알려져 있지 않고 생물학적 성상이 복잡하며, 치료에 다용되는 화학약품의 독성작용으로 인한 과민반응과 부작용으로 인해 치료에 한계가 있다. 이에 따라 최근에는 암의 효과적인 치료법 개발을 위하여 신규물질에 막대한 연구비가 투자되고 있으며, 아울러 한약재를 이용한 많은 연구가 행해지고 있다2).

일찍이 殷墟에서 발견된 甲骨文字 상에 “瘤”라는 병명이 기재되어 있었고, 기원전 12세기의 ≪周禮≫에는 “貝責治療腫瘍”이라 하여 종양만을 전담하는 腫瘍 科가 있었으며 ≪靈樞≫에서는 “營衛不通”, “寒氣客於腸外”, “與衛氣相搏”, “邪氣居其間” 등을 원인으로 보았고 “筋瘤, 昔瘤, 腸瘤, 骨疽, 肉疽” 등으로 분류하기도 하였다3).

韓醫學에서 종양의 치료는 祛邪法과 扶正培本 및 兩者를 兼하는 扶正祛邪法 등을 시행하며4), 각 치료법을 활용한 單味劑와 處方의 항암 효과에 대한 연구가 이루어지고 있다5-8). 특히 惡性腫瘍의 발생 이론 중 하나가 인체 면역 기능의 감소9) 라는 점과 더불어 화학요법의 부작용을 해결하기 위해, 扶正祛邪法과 관련되어 길경10), 하고초11) 및 상백피12) 등의 한약물에 대한 항암 효과가 보고된 바 있다.

補陽還五湯은 ≪醫林改錯≫에 최초로 기재된 益氣化瘀法의 처방으로13), 임상에서는 허혈성뇌혈전증, 뇌색전증, 뇌동맥경화증, 뇌출혈후유증 등에 사용되고 있으며14) 고혈압 및 고지혈증15), 혈압 및 국소 뇌혈류량16), 자궁내막증17) 등에 대한 실험적 연구가 있었다. 특히 세포성과 체액성 면역을 증강시키는 것에 착안하여 항암 효과 연구가 있었으나18) 전신투여와 복강 내 투여 방법이었고 경구투여에 의한 보고는 아직까지 없었다.

이에 저자는 補陽環五湯 추출물의 경구투여 후 면역 활성화에 따른 암 전이 억제 효과를 알아보기 위하여 Peyer's patch cell의 골수세포 증식 활성, granulocytemacrophage colony stimulating factor(GM -CSF) 및 interlukine-4(IL-4)의 분비 활성 이용한 장관 면역계 활성 효과, OVA와 함께 경구투여 후 소장과 혈청 내에서 항체 생산 효과 및 종양 전이 억제 효과를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

 

Ⅱ. 실 험

1. 재 료

1) 약 제

실험에 사용한 補陽環五湯 추출물을 경희대학교 한의과대학 부속병원에서 구입한 후 phosphate buffer saline(PBS)를 첨가하여 20 mg/ml의 stock solution을 제조하여 ˗20℃에 보관하였으며 1첩 약제의 구성과 분량은 Table 1과 같다.

Table 1.The Contents of Boyanghwano-tang

2) 동 물

생후 6~7주령의 C3H/He, 雌性 BALB/c 마우스를 (주)중앙실험동물(Korea)에서 분양 받아 정수된 물과 사료(Samyang Co. Ltd., Korea)를 자유 공급하였다. 실험실 환경은 온도 22℃, 습도 50% 및 12시간 간격으로 자동 조명되는 상태에서 스트레스를 받지 않도록 주의하여 사육하였다.

3) 시 약

실험에 사용한 Roswell park memorial institute(RPMI)-1640과 Eagle's minimal essential medium(EMEM), fetal bovine serum(FBS), PBS, Hank’s balanced salt solution(HBSS), Tween20는 Gibco(Rockville, MD, USA)에서, cell counting kit(EZCytox) 는 Daeil Lab(Seoul, Korea)에서 cytokine 분석 kit는 Pharmingen(USA) 에서 구입하여 사용하였다. OVA, Lipopoly -saccharide(LPS), Bouin's 용액, 3,3’,5,5’- tetramethlbenzidine(TMB)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

4) 세포주와 세포배양

Colon26-M3.1 carcinoma cell은 일본 북해도대학 면역과학연구소에서 기증받은 것으로 7.5% FBS가 함유된 EMEM으로 5% CO2, 95% 습도 및 37℃의 환경에서 배양하였다.

2. 방 법

1) 세포 독성 측정

96-well plate에 colon26-M3.1 carcinoma cell은 5×103 cells/well, Peyer's patch cell 은 5×105 cells/well이 되도록 나누어 분주하고 125 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml 및 2000 μg/ml 농도의 補陽 環五湯 추출물을 첨가한 후 Peyer's patch cell은 LPS의 최종 농도가 5 μg/ml이 되도록 well에 첨가 후 72시간 배양하였다. 그 후 각 well에 EZ-Cytox 용액을 처리하고 2시간 동안 배양한 후 ELx800(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 補陽環五湯 추출물을 첨가하지 않는 대조군에 대한 백분율(%)과 세포 생존을 반으로 억제시키는 농도 Inhibitory concentration(IC)50으로 표시하였다.

2) 장관 면역 활성 측정

(1) Peyer's patch cell의 회수 방법

6주령 female C3H/He 마우스의 소장 외벽에 존재하는 Peyer's patch를 잘라내어 HBSS을 이용하여 조직을 파괴시켜 Peyer’s patch로부터 세포를 방출시켜 RPMI 1640-5% FBS을 이용하여 원심분리를 통해 세척 후 사용하였다.

(2) 골수세포 회수 방법

주사기를 이용하여 뼈 속으로 HBSS를 주입하여 골수세포를 시험관에 받은 후 RPMI 1640-5% FBS을 이용하여 원심분리를 통해 세척 후 사용하였다.

(3) 골수세포 증식 활성 측정

2.5×106 cells/ml의 골수세포를 96-well plate에 100 μl씩 분주하고 Peyer's patch cell과 5 μg/ml, 50 μg/ml 및 500 μg/ml의 補陽環五湯 추출물을 반응시켜 회수 한 배양 상등액을 각각 50 μl씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일 동안 배양하였다. 배양 완료 후 EZ-Cytox 용액을 첨가하여 4시간 후 ELx800(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 saline을 첨가하였다.

(4) GM-CSF와 IL-4의 측정

Peyer's patch cell을 2×106 cells/ml로 조정하여 96-well plate에 각각 180 μl plating하고 5 μg/ml, 50 μg/ml 및 500 μg/ml 농도의 補陽環五湯 추출물 20 μl와 함께 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일 동안 배양하였다. 상등액을 회수하여 GM-CSF 와 IL-4를 각 cytokine 분석 kit를 이용하여 조사하였다.

3) 면역 증강 측정

(1) 혈청과 소장 내용물의 회수 방법

OVA의 IgA 항체가 측정을 위한 혈액과 소장 내용물의 채취는 OVA 단독 혹은 OVA에 補陽環五湯 추출물 0.4 mg와 4 mg을 혼합하여 1차와 2차 경구 투여한 후 마우스를 희생시켜 혈액을 얻어 10분 동안 6,000 rpm으로 원심 분리하여 혈청을 얻었다. 소장 내용물은 소장과 대장의 경계로부터 소장쪽으로 20 cm를 잘라내어 200 μl의 버퍼로 두 번 세척하여 수거하여 10분 동안 1,000 rpm으로 원심분리하고 상등액을 수집하였다. 수집된 혈청과 소장 내용물은 ˗20℃에서 항체 분석까지 보관하였다.

(2) IgA 항체 역가 측정

96-well plate에 항원으로 사용한 OVA를 코팅용액(50 mM sodium bicarbonate buffer, pH 9.6)에 50 μg/ml로 용해 후 각 well 당 100 μl씩 첨가하고 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 세척용액(PBS+0.05% Tween20)을 이용하여 plate를 세척 한 후, 10% 탈지분유를 이용하여 상온에서 2시간 동안 blocking하였다. 세척용액으로 plate를 세척 후 혈청과 소장 내용물의 항체 양에 따라 적정농도를 맞추어19) 혈청의 경우 100배 및 소장 내용물의 경우 2배 희석용액을 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 효소 HRP가 표지된 2차 항체를 첨가하여 반응시켰다. HRP의 기질로는 TMB를 사용하였다. 발색 완료 후 2 M 황산용액 100 μl 첨가하여 발색을 중시시킨 후 ELx800을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(3) Peyer’s patch cell의 OVA 재자극에 의한 활성 측정

OVA 단독 및 OVA와 補陽環五湯 추출물 2 mg을 같이 경구투여하면서 총 2회 면역하고 7일 후 마우스로부터 얻은 Peyer’s patch cell의 농도가 3×105 cells/well이 되도록 96-well culture plate에 분주하였다. 각 well에 OVA를 최종농도 2 μg/ml, 10 μg/ml 및 50 μg/ml이 되도록 조정하여 첨가하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양시켰다. Peyer’s patch cell 증식 활성은 배양 완료 후 EZ-Cytox 용액을 첨가하고 ELx800을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4) 경구투여에 의한 종양 전이 억제 측정

군당 각각 5마리의 마우스를 이용하여 종양 접종 10일전부터 매일 1회 補陽環 五湯 추출물 0.25 mg, 1 mg 및 4 mg을 경구투여하고 암 전이를 측정하기 위하여 각 마우스에 3×104 colon26-M3.1 carcinoma cell를 정맥주사 하였다. 종양 접종 1일부터 2일 간격으로 동량의 시료를 총 7회 경구투여 하였으며 종양 접종 14일 후 마우스를 희생시키고 종양의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's 용액으로 전이된 종양을 고정시킨 후 종양의 군집 수를 dissecting microscope(Olympus SZ61, Center Valley, PA, USA)로 측정하였다. 대조군은 종양만 정맥 주사하여 조사하였다.

5) 통계처리

실험결과에 대한 통계처리는 SPSS (version 17.0)를 이용하였고, 실험군과 대조군의 비교는 One way ANOVA를 시행하였다. 사후검정은 Turkey의 B test를 시행하였으며 p<0.05를 유의한 것으로 하였다.

 

Ⅲ. 결 과

1. 세포 독성 평가

Colon26-M3.1 carcinoma cell과 Peyer's patch cell에 補陽環五湯 추출물 125 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml 및 2000 μg/ml를 투여하여 세포 생존율을 측정한 결과, colon26-M3.1 carcinoma cell의 IC50은 1080 μg/ml로 나타났고(Fig. 1), LPS를 첨가한 Peyer's patch cell의 IC50은 1000 μg/ml으로 나타났다(Fig. 2).

Fig. 1.Cytotoxicity of Boyanghwano-tang.

Fig. 2.Cytotoxicity of Boyanghwano-tang.

2. 장관 면역 활성 효과

1) 골수세포 증식 활성 효과

Peyer's patch cell에 補陽環五湯 추출물 0 μg/ml, 5 μg/ml, 50 μg/ml 및 500 μg/ml 를 첨가하여 얻은 배양 상등액을 골수세포에 첨가하여 활성도를 관찰한 결과, 대조군 0.26±0.01에 비하여 50 μg/ml와 500 μg/ml 농도에서 각각 0.37±0.02와 0.30±0.01로 나타나 통계적으로 유의하게(p<0.0001) 증 가되었다(Fig. 3).

Fig. 3.Effect of Boyanghwano-tang on Hematopoiesis.

2) Peyer's patch cell의 cytokines 분비 효과

(1) GM-CSF

Peyer's patch cell에 補陽還五湯 추출물 0 μg/ml, 5 μg/ml, 50 μg/ml 및 500 μg/ml를 첨가하여 GM-CSF의 분비를 측정한 결과, 대조군 17.45±4.03 pg/ml에 비하여 50 μg/ml 농도에서 85.25±6.01 pg/ml로 나타나 통계적으로 유의하게(p<0.05) 증가되었다(Fig. 4).

Fig. 4.GM-CSF Induction Activated with Boyanghwano-tang Extracts.

(2) IL-4

Peyer's patch cell에 補陽還五湯 추출물 0 μg/ml, 5 μg/ml, 50 μg/ml 및 500 μg/ml 를 첨가하여 IL-4의 분비를 측정한 결과, 대조군 3.25±0.78 pg/ml에 비하여 50 μg/ml 농도에서 16.80±2.69 pg/ml로 나타나 통계적으로 유의하게(p<0.05) 증가되었다(Fig. 5).

Fig. 5.IL-4 Induction Activated with Boyanghwano-tang Extracts.

3. 면역 증강 효과

1) OVA 특이적 IgA 항체 생성 효과

(1) 소장 내용물에 함유된 IgA 항체 역가

OVA 단독 및 OVA와 補陽還五湯 추출물 0.4 mg와 4 mg을 혼합하여 투여한 후 소장 내용물의 IgA 항체 역가를 조사한 결과, OVA 단독 투여군 0.45±0.07에 비하여 OVA와 補陽環五湯 추출물 4 mg 혼합 투여군에서 0.66±0.06으로 나타나 통계적으로 유의하게(p<0.05) 증가되었다(Fig. 6).

Fig. 6.IgA Induction Activated in Intestinal Content with Boyanghwano-tang Extracts.

(2) 혈액에 함유된 IgA 항체 역가

OVA 단독 및 OVA와 補陽還五湯 추출물 0.4 mg와 4 mg을 혼합하여 투여한 후 혈액 내 IgA 항체 역가를 조사한 결과, OVA 단독 투여군에 비하여 모두 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않았다 (Fig. 7).

Fig. 7.IgA Induction Activated in Serum with Boyanghwano-tang Extracts.

2) Peyer’s patch cell의 OVA 재자극에의한 활성 효과

OVA 단독 및 OVA와 補陽環五湯 추출물 2 mg을 같이 경구투여한 후 마우스로부터 얻은 Peyer's patch cell에 2 μg/ml, 10 μg/ml 및 50 μg/ml 농도의 OVA를 재자극하여 활성도를 확인한 결과, OVA 10 μg/ml에서는 補陽環五湯 추출물을 함께 투여한 군에서 0.16±0.02로 나타나 OVA 단독 투여군 0.11±0.01에 비하여 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 증가되었고, OVA 50 μg/ml 에서는 補陽環五湯 추출물을 함께 투여한 군에서 0.21±0.03으로 나타나 OVA 단독 투여군 0.14±0.01에 비하여 통계학적으로 유의하게(p<0.001) 증가되었다(Fig. 8).

Fig. 8.Proliferation of Peyer's Patch Cell with Boyanghwano-tang Extract.

4. 경구투여에 의한 종양 전이 억제 효과

Colon26-M3.1 carcinoma를 접종하기 전 후 補陽還五湯 추출물 0.25 mg, 1 mg 및 4 mg을 경구투여하고 종양의 표적기관인 폐에 나타난 종양 군집 수를 관찰한 결과, 대조군 116±19.60개에 비하여 1 mg과 4 mg 투여군에서 각각 72.60±17.30개와 59.20±14.81개로 나타나 통계적으로 유의하게(p<0.0001) 억제되었다(Fig. 9).

Fig. 9.Effect of Boyanghwano-tang Extracts in Metastasis Model.

 

Ⅳ. 고 찰

惡性腫瘍이란 신체의 거의 모든 세포에서 발생하여 목적 없이 무질서하게 비가역적으로 증가하며, 정상적인 생화학적 및 물리학적 제약을 받지 않고 스스로 발육하여 정상 조직을 파괴하는 질환이다9,20,21). 그 치료법으로 수술요법, 방사선요법 및 화학요법 등이 활용된다9). 하지만 수술요법은 轉移된 腫瘍의 치료가 불가능하다는 한계가 있으며, 방사선요법은 局所的 浸潤性 腫瘍의 치료에는 유효 하나 轉移 腫瘍의 경우에는 치료에 제한이 있으며, 정상 조직의 손상과 골수 조혈 기능 장애, 탈모, 피부이상 및 장기손상 등의 부작용이 있다9). 화학요법은 全身的 轉 移의 경우 사용 가능한 치료법이지만, 화학 항암제들은 腫瘍細胞뿐만 아니라 정상 세포에도 독성을 나타내어 腫瘍細胞를 사멸하는 동시에 骨髓造血機能을 억제하고 소화기관 및 전신에 반응하여 부작용을 유발하며, 인체의 면역 기능을 저하시키는 문제가 있다9,20).

韓醫學에서는 腫瘍에 대해 ≪靈樞≫22) 에서 腸覃, 石瘕 및 積聚 등으로 인식한 이래 巢23)는 癥瘕, 癭瘤, 石癰, 緩疽 및 石疽 등으로, 李24)는 癥積과 瘕聚로, 張25)은 積聚 등으로 인식하였다. 腫瘍 발생의 病因病機는 外感六淫, 七情內傷, 飮食不節, 過勞 및 邪毒 등의 유발요인에 의하여 개체의 臟腑機能과 氣血이 실조되어 氣滯血瘀, 痰結濕聚, 熱毒溫結, 正氣虛弱 및 經絡瘀阻 등의 병리변화가 나타나고, 이러한 변화가 單獨 혹은 相好錯雜되면서 氣機가 不通되고 오래되면 發癌하게 된다26).

腫瘍 治療는 淸熱解毒, 活血化瘀, 化痰消瘀 및 理氣消腫 등의 祛邪法과 健脾益氣, 養血滋陰, 養陰生津, 補腎溫陽 및 健脾益腎 등의 扶正培本法 및 兩者를 兼하는 扶正祛邪法으로 구분된다4). 이 중 祛邪 法은 淸熱解毒과 活血化瘀로 大別되고, 관련 연구로는 淸熱解毒 약재 중 현재 臨床에서 가장 많이 활용되는 白花蛇舌草, 瓦 松, 半枝蓮을 이용한 연구27)와 活血化瘀 작용이 있는 血府逐瘀湯 등을 이용한 항암 효과에 대한 연구28)가 있었으며, 扶正培本法 으로 溫中化胃하는 異功散 등을 이용한 항암 효과 연구29)가 있었다.

疾病의 治療를 위하여 邪氣가 重하면 祛邪를 위주로, 精氣가 虛하면 補虛를 위주로 처방하게 되는데 지금까지의 암 관련 연구에 있어서도 扶正祛邪와 活血化瘀 방법이 응용되어 비교적 높은 치료 효과를 보이고 있다. 특히 活血化瘀 藥物은 면역 세포의 기능에 영향을 주어 세포성 면역과 체액성 면역을 증강시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있어30-32), 면역 기능 활성화를 통한 길경10), 하고초11) 및 상백피12) 등의 韓藥材에 대한 抗癌 효과 실험 논문이 보고되고 있다.

補陽還五湯은 淸代 王淸任의 ≪醫林改錯≫에 처음 수록된 처방13)으로 大補元氣하는 黃芪를 君藥으로 하고, 當歸, 赤芍藥, 蚯蚓, 川芎, 桃仁, 紅花를 臣藥으로 함으로써 活血祛瘀하고 通調脈絡하여 本虛標 實한 氣虛血瘀證을 치료하는데 補氣를 主로 하고 活血을 輔로 하는데, 補氣 효능이 있는 黃芪를 重用하여 氣를 왕성하게 하여 行血시키니 祛瘀하면서 正氣를 傷하지 않도록 하였다33-35).

補陽還五湯에 대한 실험적 연구로는 고혈압 및 고지혈증15), 혈압 및 국소 뇌혈류량16), 자궁내막증17) 등에 관한 연구가 보고되었다. 특히 活血化瘀 藥物이 면역 세포의 기능에 효과가 있는 것30-32)에 착안한 抗癌 관련 연구로 비특이적 세포 독성 T 세포의 활성 증가에 관한 연구36)와 선천 면역 활성에 관한 연구18)가 보고된 바 있다.

서양의학에서는 양약의 경구투여를 이 용한 항암 효과 연구37-39)가 활발히 진행되고 있으나, 韓藥材를 이용한 종양 전이 억제 보고는 복강 내 투여에 의한 방법으로 이루어졌으며, 경구투여 후 효과를 알아보는 것으로 홍삼산성다당체40)와 한국산 겨우살이41)를 이용한 연구가 있었다. 홍삼산성다당체 연구의 경우 경구 및 복강투여 시 투여기간, 투여용량에 따 른 항종양 효과를 비교하여 경구투여시의 적절한 투여시기와 용량을 밝히는데 의의가 있었지만, 홍삼산성다당체와 한국산 겨우살이 연구 모두 세포 독성 단계의 항종양 효과를 확인하였으며, 자세한 체액성 면역에 관한 기전은 부족한 한계가 있었다.

이에 저자는 補陽環五湯 추출물의 in vitro에서 골수세포 생성 증가와 cytokines 분비 증가를 통하여 장관 면역계 활성 효과에 대하여 알아보았고, 이후 OVA와 補陽環五湯 추출물을 함께 경구투여한 후 소장 내용물과 혈청에서 IgA 항체 생산 증가, OVA 재자극 시 Peyer's patch cell 의 활성 증가를 통하여 면역 증강 효과 를 알아보았다. 그리고 이를 근거로 補 陽環五湯 추출물의 경구투여 후 전이암 세포 수를 확인함으로서 종양 전이 억제 효과에 대하여 알아보았다.

補陽環五湯 추출물의 colon26-M3.1 carcinoma cell와 Peyer's patch cell에 대한 독성을 알아보기 위하여 세포 생존율을 in vitro에서 조사한 결과 colon26-M3.1 carcinoma cell에서 IC50은 1150 μg/ml이 었으며, LPS 첨가 시 Peyer's patch cell에 서 IC50은 1000 μg/ml로 나타나 실험에 사용할 補陽環五湯 추출물의 농도를 5 μg/ml, 50 μg/ml 및 500 μg/ml로 정하였다.

면역반응에 관여하는 세포들은 기능의 효과적인 수행을 위해 조직이나 기관을 구성하게 되는데, 이를 림프계라 한다. 림프계는 실질적으로 림프구를 생산하고 분화시키는 1차 림프 조직계와, 림프구와 항원과의 접촉 또는 림프구간의 상호작용을 돕는 2차 림프 조직계로 분류된다. 2차 림프 조직계 중 생체림프조직의 1/3이상을 차지하는 점막림프기관은 호흡계 관련 림프조직, 비강 관련 림프조직 및 장관 관련 림프조직으로 구분되며 장관 관련 림프조직은 생체에서 가장 큰 림프 조직으로 소화기를 통하여 장관으로 이입되는 외래물질에 대한 점막 면역 기능을 유도함으로써 외래물질에 대한 방어 기능을 담당하고 있다42). 장관 관련 림프조직을 구성하는 면역 기관 중에서 Peyer's patch는 장관 면역계를 담당하는 가장 중요한 면역 기관이며, 소화계를 통하여 이입된 감염성 물질 대부분이 유입되는 유도 부위로서 항원의 흡수를 담당하는 special M cells, 탐식세포(Phagocytes), B cell 영역 및 T cell 영역으로 구성되어 있다43).

補陽環五湯 추출물에 의한 골수세포 증식 활성을 알아보기 위하여 마우스의 대퇴부 뼈로부터 회수하여 얻은 골수세포에 補陽環五湯 추출액과 Peyer's patch cell 의 반응으로부터 회수한 배양 상등액을 첨가하여 관찰한 결과, 대조군에 비해서 50 μg/ml 및 500 μg/ml의 補陽環五湯 추출물에서 증가되었다. 또한 배양 상등액 중에서 골수세포 증식 활성에 영향을 미치는 GM-CSF와 IL-4의 생성능을 측정한 결과, 50 μg/ml의 농도에서 대조군과 비교하여 유의하게 GM-CSF와 IL-4 분비가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

감염성 미생물 혹은 면역 반응을 유도하는 물질에 의하여 Peyer's patch을 구성하는 면역 세포가 활성화되면 근처의 2차 림프기관인 mesentric lymph node(MLN)를 통하여 장관면역계가 활성화 되고, MLN과 연결된 림프관 및 혈액을 통하여 전신적 면역 기능이 활성화된다44). 이를 근거로 補陽還五湯 추출물에 의해 Peyer's patch의 면역세포가 자극되면 골수세포의 증식에 관련되어 있는 GM-CSF와 IL-4 등이 다양하게 생성되고, 이러한 cytokine 류가 전신순환 후 최종적으로 골수세포계에 영향을 미치는 것으로 생각해볼 수 있다.

補陽環五湯의 장관 면역계 활성 효과 외에, 단백질 항원에 대한 점막 면역계 증가 효과를 확인하고자, OVA와 補陽環五湯 추출물을 동시에 경구투여한 후 소장 내용물 내에 생성된 IgA 항체 역가를 측정한 결과, OVA 단독 투여군에 비하여 OVA와 補陽環五湯 추출물 4 mg/ml 혼합 투여군에서 통계적으로 유의하게 항체 생산이 증가되었다. 이는 경구투여된 補陽環五湯 추출물이 선천면역의 보체로써 사용된 길경과 하고초와 같이 Peyer's patch cell을 자극하고 면역을 증강시키는 보체로 작용하여 장관 면역계를 활성화시킴을 알 수 있다.

현재 점막면역증강제로 가장 널리 사용되는 물질 cholera toxin(CT)에 관한 이전의 보고45)에서 CT를 항원과 동시에 경구투여한 결과 침, 질 세척액, 비강세척액 등의 여러 점막물질에서 분비형 IgA 항체 생산 뿐 아니라 혈액 내 IgA 생산도 유의하게 증가된 결과를 보여주고 있다. 따라서 補陽還五湯을 항원과 동시에 경구투여 하였을 경우 항원에 대한 점막면역뿐 아니라 전신적인 면역 증강 효과가 유도되는 것을 확인하기 위하여 OVA에 대한 혈액 내 IgA 항체 생성 효과를 측정한 결과, OVA 단독 투여군에 비하여 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않았다.

OVA의 재자극 후 Peyer's patch cell의 활성 여부를 조사한 결과, OVA 10 μg/ml 및 50 μg/ml의 농도에서 OVA 단독 투여 군에 비하여 OVA와 補陽環五湯 추출물을 함께 투여한 군에서 Peyer's patch cell 이 통계적으로 유의하게 활성화되었다. 이는 補陽還五湯이 점막 면역계를 활성화시키는 면역 증강 효과를 유도하는 기능이 있음을 보여주는 것으로 평가된다.

이상의 실험결과를 통해 補陽環五湯 추출물의 장관 면역계 활성 효과, 경구투여를 통한 점막 면역계 활성 효과를 관찰하였고 경구투여 한 후 종양 표적 기관인 폐를 적출하여 육안으로 종양 군집수를 조사한 결과, 농도 의존적인 종양 전이 억제 활성을 확인하였다.

구강을 통하여 섭취된 식품 또는 유효 성분이 소장의 Peyer's patch를 자극하게 되면 활성화된 Peyer's patch cell들은 다양한 면역 활성화 물질, 즉 cytokine 등을 다양하게 생산하게 되고 활성화된 세포와 물질이 순환하면서 전신 면역계에 영향을 줄 수 있다. 補陽環五湯 추출물의 경구투여에 의한 종양 전이 억제 효과는 구강을 통하여 섭취된 추출물의 유효성분이 소장벽의 Peyer's patch cell을 자극함으로서 cytokines 생성 증가와 점막 면역계 활성화를 통한 항체 생산 증가에 의한다고 사료된다.

일반적으로 한약 또는 식품은 생식 또 는 일부 가공한 후 구강을 통하여 섭취 되기 때문에 생리 활성을 갖는 유효성분의 실험에 있어서도 다른 투여방법보다는 경구투여에 의한 효과의 확인이 중요하다. 또한 한약에 존재하는 활성 성분은 섭취되었을 때 위와 장에서 소화 효소 혹은 장내 세균에 의해 분해될 수 있고 이러한 경우 체내에서의 면역 활성에도 영향을 줄 수 있다. 따라서 이번 연구의 의의는 in vitro 실험에서 유의적인 장관 면역 활성을 보인 약재에 대하여 in vivo 단계의 실험을 거쳐 경구투여 시의 종양 전이 억제 효과를 검증하였다는 것에 있다고 할 수 있다. 하지만 in vivo 단계의 Peyer's patch cell 활성화를 직접 관찰하지 못하였으므로, 추후 본 연구의 in vitro 실험에서 유의한 결과로 나타난 장관 면역계 활성을 근거로, 확실한 활성을 조사하기 위하여 in vivo 유도 Peyer's patch cell의 활성에 대한 연구가 진행되어야 하겠다.

 

Ⅴ. 결 론

補陽環五湯 추출물의 경구투여 후 면역 활성화에 따른 암 전이 억제 효과를 알아 보기 위하여 Peyer's patch cell을 이용한 장관 면역계 활성 효과, OVA와 함께 경구투여 후 소장과 혈청 내에서 항체 생산 효과 및 종양 전이 억제 효과를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 補陽環五湯 추출물 125 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml 및 2000 μg/ml 투여군에서 세포 생존율을 측정한 결과, 종양세포에서의 IC50은 1150 μg/ml이였고, 정상세포의 IC50은 LPS에서 1000 μg/ml이었다. 2. Peyer's patch cell을 5 μg/ml, 50 μg/ml 및 500 μg/ml 농도의 補陽環五湯 추출물로 자극한 배양 상등액의 골수세포 증식 활성도를 조사한 결과, 50 μg/ml 와 500 μg/ml 농도에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 증가되었다. 3. Peyer's patch cell을 5 μg/ml, 50 μg/ml 및 500 μg/ml 농도의 補陽環五湯 추출물로 자극하여 cytokine GM-CSF와 IL-4의 분비를 관찰한 결과, 50 μg/ml 농도에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 증가되었다. 4. OVA 단독 및 OVA와 補陽環五湯 추출물 0.4 mg 및 4 mg을 혼합하여 경구투여 후 소장 내용물에 포함된 IgA 항체 역가를 측정한 결과, OVA와 4 mg 혼합 투여군에서 OVA 단독 투여군에 비하여 통계적으로 유의하게 증가되었다. 5. OVA 단독 및 OVA와 補陽環五湯 추출물 2 mg을 함께 경구투여한 후 마우스로부터 얻은 Peyer’s patch cell을 2 μg/ml, 10 μg/ml 및 50 μg/ml 농도의 OVA로 재자극하여 활성도를 확인한 결과, OVA 10 μg/ml와 50 μg/ml 농도 재자극 시 각각 補陽環五湯 추출물과 함께 투여한 군에서 OVA 단독 투여군에 비하여 통계학적으로 유의하게 증가되었다. 6. Colon26-M3.1 carcinoma 접종 전후 補陽還五湯 추출물 0.25 mg, 1 mg 및 4 mg을 경구투여한 후 종양의 표적기관인 폐에 나타난 종양 군집 수를 관찰한 결과, 1 mg과 4 mg 투여군에서 대조 군에 비하여 통계적으로 유의하게 억제되었다.