쪽 니람의 DNCB 유발 생쥐의 아토피 피부염에 미치는 효과

The Effect of the Polygonum tinctoria Niram on Atopic Dermatitis in DNCB-Induced Hairless Mice

Abstract

Objectives : The purpose of this study was to investigate the effects of Polygonum tinctoria Niram(PTN) on atopic dermatitis(AD) in hairless mice induced by 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB). Method : They were divided into four group, Nor, Con, 1X and 5X, for evaluating the change of appearance of skin surface, skin hydration, thickness of epidermis and mast cell numbers during 30 days. Results : PTN suppressed symptoms of AD in appearance of skin and increased skin hydration for 1X and 5X. In histopathological examination, 1X and 5X significantly reduced the thickness of epidermis and number of mast cell in dermis. These results suggested that the PTN improved the AD-like symptoms of hairless Mice.

Ⅰ. 서 론

아토피 피부염(Atopic Dermatitis, AD)은 영유아기부터 발병이 시작되어 가려움을 동반하는 만성재발성 습진질환이다. 호산구 다량 침윤, 비만세포의 탈과립화에 따른 히스타민 배출, IgE의 증가 등에 따른 면역학적 변화가 심한 피부발진현상을 야기시킨다. 발병원인은 가족력, 피부감염, 음식섭취, 환경오염, 모유수유 감소, 기후변화 등으로 알려져 있다1-3).

쪽(Polygonum tinctoria)은 마디풀과의 한해살이풀이며 식물성 염료로 청색 염색에 이용되며 동양에서 남(藍), 서양에서는 indigo라고 알려져 있다4). 고대시절부터 해충 피해가 적은 장점을 활용하여 옷감 및 종이 염색과 해독 작용에 탁월한 효과가 있어 약재로도 사용되어졌다. 인디고틴(Indigotin)과 인디루빈(Indirubin)이 함유되어 있어 항균성과 항암성이 있다고 보고되었으며5), 항암6,7), 아나필락시 알러지 반응 억제8)와 항 HIV-19), 항염증10) 등의 면역력에 영향을 주어 다양한 질병 치료 효능이 선행연구를 통해 알려졌다. 이 식물은 요람(蓼藍), 인도람(印度藍), 대청(大靑), 유구람(流球藍)으로 분류되어 있어 그 쓰임과 형태가 매우 다양하다11). 생잎의 즙액으로 직접 염색하는 방법과 발효염색 또는 화학적 환원염색 방법으로 쓰이고 있다12).

AD는 환자와 그 주위사람에겐 삶의 질과 가치를 악화시키는 질환이며, 세계적으로 환자 발생률이 증가되고 있다. 치료제로서 스테로이드 제제 및 항히스타민제 등이 사용되나 많은 부작용이 발생하고 질병의 완치를 기대하기는 어렵다13). 본 연구에서는 Polygonum tinctoria Niram(PTN)이 AD 동물에서의 치료 효능을 조사함으로써 의약품, 섬유나 코스메틱 산업 등으로의 개발 가능성을 확인하고자 하였다.

 

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 쪽 니람

쪽(Polygonum tinctoria) 니람은 나주 천연염색문화관에서 구입하여 사용하였다.

2. 실험 동물

6주령인 hairless mice를 오리엔트바이오(Orient Co., Iksan, Korea)로부터 구입하여 항아토피 피부염 실험에 사용하였다. 실험군 분류는 정상군(Nor), 대조군(Con), 쪽 니람 희석 1%(1X)와 희석 5%(5X)로 분류하였다. 실험동물은 동신대학교 한의과대학 동물사육실에서 일정한 조건(온도 : 21±2℃, 습도 : 50-60%, 12시간 주기 명/암)하에서 일반 고형사료(샘타코, 흰쥐 용)와 물을 충분히 공급하면서 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

3. 아토피질환 유발

Acetone과 olive oil을 4:1의 배합으로 섞은 후 2.5% 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)와 0.2% DNCB 유발제를 제조하였다. 2.5% DNCB는 3일 간격으로 2회 100ul씩 도포 후 0.2% DNCB를 3일 간격으로 2회 100 uL씩 총 4회 도포하여 아토피질환을 유발시켰다.

4. 쪽 약물 치료

쪽 약물 치료를 위해 PTN을 증류수에 1%(1X)와 5%(5X)로 희석하고 냉장 보관하여 사용하였다. 2주동안 2일에 1회씩 각각 200 ul씩 피부에 도포하여 치료 변화를 관찰하였다. 아토피 질환유발이 자연 치유됨을 방지하기 위하여 0.2% DNCB를 Con, 1X, 5X에 주 2회 200 ul씩 도포하였다.

5. 육안 관찰

흡입마취제(이소플루란)를 사용해 전신마취 후 제모한 mice의 등 부분을 사진 촬영하고 관찰하였다.

6. 피부 수분함유량

피부 표면의 수분량 측정은 corneomater CM825(Courage-Khazaka electronic GmbH, Germany)를 사용하여 측정하였다. 이 기기는 피부표면(예: 각질층)의 수분함유량을 정전부하용량(capacitance) 계측법으로 측정한다. 각질층 하방 깊이 이내 (10-20um)의 수분함유량을 측정하는 기능(conductor track in electric scatter field)을 갖고 있으며 피부 보습력의 평가지침으로서 이용되고 있다. 보습도가 높을수록 측정수치가 높아지며, 단위는 arbitrary unit(AU)이다14).

7. 조직의 처리 및 epidermis 두께 측정

피부를 관찰하기 위하여 mice를 도살한 후 각각 조직을 적출하여 10% 포르말린에 24시간 고정시킨 다음, 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100 Ⅰ, 100 Ⅱ와 같이 알코올 농도를 상승시켜 조직 속의 수분을 제거한 후 xylene으로 투명화 과정을 거친 후 paraffin으로 포매하였고, 포매된 조직을 microtome을 사용하여 5㎛ 두께로 절편하였다. 절편한 조직을 slide glass 위에 부착시키고 xylene으로 paraffin을 제거한 다음 100%, 90%, 80% ethanol과 같이 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 담구어 함수과정을 거치게 하였다. 그 조직은 epidermis, dermis, keratinocytes, neutrophils, eosinophil과 그 외 다른 세포와 부종을 식별 할 수 있는 hematoxylin & esoin 염색을 한 다음 탈수 후 Canada balsam 으로 봉입하고 카메라 부착 광학현미경(Nikon Eclipse 80i, Tokyo, Japan)으로 200배로 촬영하고 마리당 5구역의 epidermis의 두께를 측정하였다.

8. 피부조직 내 mast cell 수 측정

피부조직의 염증세포의 침윤을 알아보기 위하여 비만세포를 염색하였다. 조직 절편을 70% alcohol에 녹인 1% toluidine blue stock solution을 pH2.3의 1% sodium chloride에 1:9의 비율로 섞어서 사용하였다. Xylene으로 paraffin을 제거한 다음 100%, 90%, 80% ethanol과 같이 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 담궈 함수과정을 거친 후 toluidine blue working solution에 2~3분간 염색하였다. 그 후 증류수로 3번 수세하고, 50, 70, 80, 90, 95, 100 Ⅰ, 100 Ⅱ와 같이 알코올 농도를 상승시켜 빠르게 담갔다가 꺼냈다. 조직 속의 수분을 제거한후 xylene으로 투명화 과정을 각 2번씩 3분간 씻었다. 건조 후 canada balsam으로 봉입하였다. 광학현미경으로 200배에서 마리당 5구역씩 관찰하여 비만세포 수를 세어 계산하였다.

9. 통계처리

실험 결과는 Mean±SE로 나타냈으며, 대조군과 실험군 사이의 평균 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 나타내었다.

 

Ⅲ. 결 과

1. 육안관찰

Fig. 1은 DNCB 용액으로 아토피 질환을 유발한 뒤 쪽 니람으로 치료하는 동안의 마우스 등 피부 모습의 사진이다. 정상군을 제외하고 대조군과 실험군 모두 유발 후 피부에서 심한 홍반, 인설, 가피, 태선화 염증, 출혈, 피부건조 등의 증상이 나타남으로 유발이 잘 되었음을 확인할 수 있었다. 시간이 지남에 따라 가피는 제거되었지만 아토피로 인한 홍반과 상처는 남아있었다. 실험군에 2일 간격으로 2주 동안 쪽 니람을 등 부위에 도포하고 변화를 관찰하였다. 그 결과, 약물 치료한 실험군의 아토피 증상이 점차 완화되었고 피부 상태도 매끄러워졌으며 상처나 홍반이 치료됨을 알 수 있었다. 실험 종료 시점에서 대조군의 아토피 증상 유지와 비교하였을 때 쪽 니람은 아토피 치료에 효과가 있는 것으로 육안적으로 관찰되었고, 농도의 차이에 따라서도 5X의 높은 농도의 치료가 효과가 있음을 확인하였다.

Figure 1.Effect of Polygonum tinctoria niram on clinical skin features of DNCB-applied hairless mice. Normal, No treated group; Control, DNCB only group; 1X, DNCB+1% PTN group; 5X, DNCB+5% PTN group.

2. 수분함유량의 변화

Hairless mice의 등 외피 수분 함유량의 변화를 실험 기간 동안 corneometer로 측정하였다(Fig. 2). 유발하기 전엔 모든 군에서 비슷한 수분 함유량을 나타내었으나 대조군과 실험군은 유발이 시작되면서부터 급격한 감소를 보였다. PTN을 도포한 후 실험군은 수분 함유량이 점차 증가되었음을 확인하였다. 정상군은 27.2±5.9 AU로 실험기간 동안 수치의 큰 변화가 없었으며, 대조군은 점차 감소되어 9.9±2.1 AU로 가장 낮은 값을 나타내었다. 1X와 5X는 각각 11.4±2.5 AU와 14.5±2.4 AU로 유발시기 때보다 증가함을 보였다. 이와 같은 결과로 PTN이 아토피 질환이 있는 피부 표면의 수분함유량의 변화에 영향을 주었으며, PTN의 농도가 증가함에 따라 더 큰 치료 효과를 확인할 수 있었다.

Figure 2.Changes of the mean value of the skin hydration in dosal skin of DNCB-applied hairless mice. Normal, No treated group; Control, DNCB only group; 1X, DNCB+1% PTN group; 5X, DNCB+5% PTN group.

3. Epidermis의 육안적 관찰

Hairless mice의 등 피부 조직을 H&E 염색하여 피부 표면 변화를 관찰한 결과, 정상군에서는 epidermis의 두께가 얇고 세포 배열의 균일함을 확인할 수 있었으며 DNCB 유발 후 약물 무처리구인 대조군에서는 epidermis의 두께가 확장됨이 나타났다(Fig. 3-A, Fig. 3-B). 실험군인 1X와 5X는 대조군보다 얇은 두께의 epidermis가 관찰되었다 (Fig. 3-C, Fig. 3-D).

Figure 3.Histology of dosal skin lesions in DNCB-applied hairless mice. Normal(A), No treated group; Control(B), DNCB only group; 1X(C), DNCB+1% PTN group; 5X(D), DNCB+5% PTN group. Ep, epidermis; D, dermis. Hematoxylin & Eosin staining, Original magnification×200.

4. Epidermis의 두께 변화

Hairless mice의 등 피부 조직을 H&E 염색하고 눈금측정이 가능한 현미경을 사용하여 epidermis의 두께를 측정하였다. Fig. 4에서 정상군(32.00±2.00 um)의 두께가 가장 얇게, 대조군(273.00±23.57 um)의 두께는 가장 두껍게 측정되었다. 실험군인 1X(89.33±8.19 um)은 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타났으며, 5X(42.67±3.45 um)도 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4-C, Fig. 4-D).

Figure 4.Thickness of epidermis in dosal skin of DNCB-applied hairless mice. Normal, No treated group; Control, DNCB only group; 1X, DNCB+1% PTN group; 5X, DNCB+5% PTN group. Significant differences were compared with normal at ###p< 0.001 or control * **p< 0.001. All value are mean±S.E.(n=5).

5. 피부 조직 내 mast cell의 변화 관찰

AD인 mice의 dermis의 비만세포를 관찰하기 위해 toluidine blue staining을 실시하였다. 정상군에서는 비만세포가 거의 보이지 않았으며(Fig. 5-A), 대조군에서는 비만세포가 다수로 발견되었고(Fig. 5-B) 정상군에 비해 뚜렷한 증가를 나타내 AD의 유발이 정상적으로 이루어짐을 확인할 수 있었다. 1X와 5X는 대조군보다 비만세포의 감소됨이 확인되었다(Fig. 5-C, Fig. 5-D).

Figure 5.Effect of Polygonum tinctoria niram on mast cell infiltration in dosal skin of DNCB-applied hairless mice. Normal, No treated group; Control, DNCB only group; 1X, DNCB+1% PTN group; 5X, DNCB+5% PTN group. Arrows indicate mast cells. Toluidine blue staining, Original magnification×200.

6. Mast cell 수의 변화

Hairless mice의 등 피부 조직을 toluidine blue staining하고 dermis에 있는 비만세포 수를 측정하였다. 정상군(25.70±1.96)이 가장 낮은 비만세포수를 나타냈고, 대조군(61.80±3.50)이 가장 높은 수를 나타내었다. 실험군인 1X(44.10±3.14)와 5X(32.40±2.64)는 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig. 6).

Figure 6.Number of mast cells in dermis of DNCBapplied hairless mice. Normal; No treated group, Control; DNCB only group, 1X; DNCB+1% PTN group, 5X; DNCB+5% PTN group. Significant differences were compared with normal at ###p< 0.001 or control * *p< 0.01; * **p< 0.001. All value are mean±S.E. (n=5).

 

Ⅳ. 고 찰

아토피 피부염(Atopic Dermatitis)은 발진, 염증, 가려움증, 피부건조 등의 증상이 나타나며, 유전적, 면역학적, 환경적, 피부 기능 저하 등의 다양한 요인으로 발생되는 피부질환이다15). AD는 전 세계적으로 꾸준히 증가하는 것으로 보고되었고, 30년 전보다 현재 환자가 약 3배정도 증가되었다16). 인구의 약 1%가 AD를 가지고 있으며, 유아의 5-10%가 질환으로 치료를 받고 있어 국가의 보건 문제로서 해결방안이 시급하다17). 현재까지 AD의 원인과 발병기전은 밝혀지지 않았을 뿐만 아니라 정확한 진단방법과 결정적인 방법이 없기 때문에 진단과 치료가 매우 어렵고18), 국소부신피질호르몬제, 항히스타민 및 항생제 등의 약물에 의존적인 일시적 치료만 행해지고 있다19). 이러한 약물은 피부 손상, 말초혈관확장, 일광에 대한 과민성 등의 많은 부작용이 야기되며, 항생제 복용과 레이저 치료 등과 같은 계속적인 치료에 대한 경제적 및 정신적 부담이 환자들에게 극심한 스트레스를 주고 있다.

본 연구에 사용된 쪽은 순수한 한글이름으로 조선시대부터 불리었고, 쪽의 사용은 그보다 훨씬 전부터 염료로서 사용되었다고 기록되었다. 일반적으로 쪽잎의 부분을 추출하여 청색을 나타내는데 사용되는 염재이다20). 국내에서는 전남 나주를 중심으로 재배중이며, 가장 널리 알려진 침전 염법이 염색의 전통방법이다. 쪽잎을 항아리에 넣고 3일 정도 방치함으로 색소를 용출한 뒤에 조개 또는 굴 껍질을 구워 만든 석회가루를 첨가하여 공기중에서 교반하고 얻어진 청색의 침전물인 니람을 발효해서 섬유를 염색할 때 이용되고 있다21).

따라서 본 연구에서는 AD의 치료에 효과가 있을 것으로 제시한 PTN을 질환이 유발된 생쥐의 피부에 도포하여 육안과 조직학적 등으로 관찰하고 분석하였다.

Hairless mice에 DNCB 용액을 제조하여 일정기간 동안 도포하고 유발을 확인한 후, 실험군에 PTN을 도포하여 치료의 효능을 육안으로 확인한 결과, AD의 증상이 점차 개선되었고, 피부상태도 상처와 홍반이 감소됨을 관찰하였다. 수분함유량을 사육 기간 동안 측정한 결과, 실험군의 PTN도포가 실험종료 시기에 대조군보다 높은 수분함유량을 나타내어 AD의 치료 효능에 도움이 되는것으로 사료된다.

AD가 발병되면 T세포 매개성 염증세포의 침윤에 따라 피부 부종 및 조직의 비후 현상이 발생하여 피부의 epidermis 두께가 증가한다22,23). 신선초 추출물22), 은행잎15), 아토피 크림과 자운고24), 탁리소독음 합 황련해독탕25), 편백잎 추출물26) 등의 연구를 살펴보면 대조군보다 약물이나 치료를 실시한 실험군의 epidermis의 두께가 유의적으로 감소함이 확인되어 본 연구의 결과와 일치함을 나타내었다. PTN의 피부 도포가 epidermis의 두께 감소 효과와 관련이 있는 것으로 보아 AD 치료에 대한 효과를 기대할 수 있다.

비만 세포(mast cell)는 알러지 질환 및 염증질환의 매개 물질을 생성하는 주요 세포이며27), 즉시형 과민성 반응을 촉진하는 히스타민 분비에 중요한 역할을 한다28). 이러한 비만 세포를 관찰하기 위해 설치류와 사람의 결합조직의 관찰 가능한 toluidine blue 염색을 실시하여, 이염색성 (metachromatic staining)에 반응한 세포를 관찰하였다29). Zheng et al.30)와 Kim et al.31) 등의 연구결과에서 비만세포 수가 감소하는 것은 질병치료에 효과가 있는 것이라고 보고하였다. 대조군의 비만세포수 증가에 따라 AD의 유발이 정상적으로 진행됨이 조사되었고, PTN을 도포한 실험군에 대한 비만세포 수의 감소에 따라 치료 가능성을 확인하였으며, AD의 증상 억제에 도움을 줄 것으로 사료된다.

이상의 결과로 PTN의 도포는 AD가 유발된 피부의 증상완화, 항염증, 급성 과민반응이 가시적으로 효과를 나타내었다. 따라서 AD의 PTN 치료제 개발에 유효하게 활용할 수 있을 것으로 사료되며, 향후 다양한 효능 차이, 임상 실험 및 세포 독성의 연구들이 필요할 것으로 생각된다.

 

Ⅴ. 결 과

PTN이 DNCB로 유도된 hairless mice의 AD에 대한 효능을 조사하였다. 30일 동안 Nor, Con, 1X와 5X의 4개군으로 나누어 육안관찰, 수분함유량, epidermis 두께와 비만 세포 수의 변화를 조사하였다.

1. PTN은 육안관찰에서 AD 증상을 억제시켰고, 수분함유량은 1X와 5X에서 대조군보다 증가됨이 나타났다.

2. 조직학적 관찰 결과, epidermis의 두께와 비만세포의 수가 유의적으로 감소되었다.

이상의 결과로 PTN은 hairless mice의 AD 증상에 대하여 치료 효과가 있는 것으로 판단된다.