초고속 이단계 PCR에 의한 Shiga 독소 타입 1의 신속 검출법

Rapid Detection for Shiga Toxin Type 1 (Stxl) by Using Two-Step Ultra-Rapid Real-Time (URRT) PCR

  • 김일욱 (경기대학교 자연과학대학 생명과학과) ;
  • 강민희 (경기대학교 자연과학대학 생명과학과) ;
  • 권순환 (아주대학교 의과대학 만성염증질환센타) ;
  • 조성학 (질병관리본부 장내세균팀) ;
  • 윤병수 (경기대학교 자연과학대학 생명과학과)
  • Kim, Il-Wook (Department of Biology, Kyonggi University) ;
  • Kang, Min-Hee (Department of Biology, Kyonggi University) ;
  • Kwon, Soon-Hwan (Chronic Inflammatory Disease Research Center, School of Medicine, Ajou University) ;
  • Cho, Seung-Hak (Team of Enterobacteria, Korean Centers for Disease Control and Prevention) ;
  • Yoon, Byoung-Su (Department of Biology, Kyonggi University)
  • 발행 : 2008.09.30

초록

Shiga 독소 생성 대장균(Shiga toxin-producing Escherichia coli; STEC)을 가장 빠르게 검출할 수 있는 초고속 이단계 PCR 방법을 개발하였다. 검색 대상 유전자는 STEC에서 생성되는 Shiga 독소(Shiga toxin; Stx)를 암호화하고 있는 유전자 stx1이며, 1쌍의 stx 유전자 특이 primer를 사용하여 검출을 수행하였다. 초고속 PCR (Ultra-rapid PCR)은 microchip 기반의 6 ${\mu}l$ PCR 용량의 Real-time PCR을 사용하고, PCR 회전의 각 단계 중 혼성과 중합을 한 단계로 하였을 뿐 아니라, 각 단계의 적용시간을 각 1초, 3초(해리, 혼성/중합)가 되게 극단적으로 줄여, 검사소요시간을 최소화하였다. 35회전의 PCR 진단에 사용된 시간은 6분38초였으며, 용융온도분석에서 stx1 특이 유전자가 검출되었음을 확인하는 데까지 총 7분 28초가 소요되었다. 또한 민감도 측정에서 $3{\times}10^0$ CFU/reaction까지 성공적으로 검출 가능함이 확인되었고, 용융온도분석에서 이 증폭산물은 일정한 $81.42{\pm}0.34^{\circ}C$의 용융온도를 갖는 것으로 확인되었다. 이 검사법을 다양한 STEC 균주들에게 적용하여 그 성능을 검증하였으며, 이로써 본 초고속 이단계 PCR 방법은 Shiga 독소 생성 대장균의 초신속 검출에 바로 적용될 수 있을 것으로 기대한다.

Rapid detection-method for Shiga toxin type 1 that was produced from Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) was developed by two-step ultra-rapid real-time (URRT) PCR. The specific primers were deduced from 80 bp stable region of stx type 1 (stxl) gene among various informations of STEC strains. URRT PCR is a microchip-based real-time PCR using 6 ${\mu}l$ of reaction volume with extremely short denaturation step and annealing/extension step (1 sec, 3 sec, respectively) in each cycle of PCR. Using the stx1-specific URRT PCR, 35 cycled PCR were finished in time of 6 min and 38 see, also measured 7 min and 28 see including melting temperature (Tm) analysis. The detection-limit of stxl-specific URRT-PCR was estimated until 3 colony forming units / PCR with products with stable Tm at $81.42{\pm}0.34^{\circ}C$. In the applications to various STEC strains and contaminated genomic DNAs, stx1-specific URRT-PCR were tested and shown that it would be expected an useful method for the rapid detection of stx1-coded STEC strains.

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참고문헌

  1. 김을환, 이동우, 한상훈, 임윤규, 윤병수. 2007. 조류인플루엔자 H5N1바이러스 유전자의 신속 검출을 위한 초고 속 다중 실시간 PCR법의 개발. 대한수의학회지 47, 399-407
  2. 김호훈, 강연호, 김성한, 박미선, 유재연, 전정훈. 1998. 장출혈성 대장균 형청군 O157, O26, O25, O55, O103, O104, O111 및 O145 가토면역 항혈청의 응집소 특이성에 관한 연구. 대한미생물학회지 33, 499-505
  3. 이동우, 김을환, 유미선, 김일욱, 윤병수. 2007. Human Immunodeficiency Virus (HIV) 검출을 위한 초고속 이단계 PCR 진단법. 한국미생물학회지 43, 264-272
  4. Beutin, L., A. Miko, G. Krause, K. Pries, S. Haby, K. Steege, and N. Albrecht. 2007. Identification of human-pathogenic strains of Shiga toxin-producing Escherichia coli from food by a combination of serotyping and molecular typing of Shiga toxin genes. Appl. Environ Microbiol. 73, 4769-4775 https://doi.org/10.1128/AEM.00873-07
  5. Blanco, J.E., M. Blanco, M.P. Alonso, A. Mora, G. Dahbi, M.A. Coira, and J. Blanco. 2004. Serotypes, virulence genes, and intimin types of Shiga toxin (verotoxin)-producing Escherichia coli isolates from human patients: prevalence in Lugo, Spain, from 1992 through 1999. J. Clin. Microbiol. 42, 311-319 https://doi.org/10.1128/JCM.42.1.311-319.2004
  6. Boerlin, P., S.A. McEwen, F. Boerlin-Petzold, J.B. Wilson, R.P. Johnson, and C.L. Gyles. 1999. Associations between virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli and disease in humans. J. Clin. Microbiol. 37, 497-503
  7. Caprioli, A., S. Morabito, H. BrugEre, and E. Oswald. 2005. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet. Res. 36, 289-311 https://doi.org/10.1051/vetres:2005002
  8. Cho, Y.K., J. Kim, Y. Lee, Y.A. Kim, K. Namkoong, H. Lim , K.W. Oh, S. Kim, J. Han, C. Park, Y.E. Pak, C.S. Ki, J.R. Choi, H.K. Myeong, and C. Ko. 2006. Clinical evaluation of micro-scale chip-based PCR system for rapid detection of hepatitis B virus. Biosens. Bioelectron. 21, 2161-2169 https://doi.org/10.1016/j.bios.2005.10.005
  9. Han, S.H., D.B. Lee, D.W. Lee, E.H. Kim and B.S. Yoon. 2008. Ultra-rapid Real-time PCR for the detection of Paenibacillus larvae, the causative agent of American Foulbrood (AFB). J. Invertebr. Pathol. (in print; online available)
  10. James, C.P. and W.P. Adrienne. 1998. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clin. Microbiol. Rev. 11, 450-479
  11. James, P.N. and B.K. James. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 11, 142-201
  12. Kehl, S.C. 2002. Role of the laboratory in the diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli infections. J. Clin. Microbiol. 40, 2711-2715 https://doi.org/10.1128/JCM.40.8.2711-2715.2002
  13. Klein, E.J., J.R. Stapp, M.A. Neill, J.M Besser, M.T. Osterholm, and P.I. Tarr. 2004. Shiga toxin antigen detection should not replace sorbitol MacConkey agar screening of stool specimens. J. Clin. Microbiol. 42, 4416-4417 https://doi.org/10.1128/JCM.42.9.4416-4417.2004
  14. Schuurman, T., A. Roovers, W.K. Van Der Zwaluw, A.A. Van Zwet, L.J. Sabbe, A.M. Kooistra-Smid, and Y.T. Van Duynhoven. 2007. Evaluation of 5'-nuclease and hybridization probe assays for the detection of shiga toxin-producing Escherichia coli in human stools. J. Microbiol. Methods 70, 406-415 https://doi.org/10.1016/j.mimet.2007.05.016
  15. Sharma, V.K. and E.A. Dean-Nystrom. 2003. Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 by using a multiplex realtime PCR assay for genes encoding intimin and Shiga toxins. Vet. Microbiol. 93, 247-260 https://doi.org/10.1016/S0378-1135(03)00039-7
  16. Teel, L.D., J.A Daly, R.C. Jerris, D. Maul, G. Svanas, A.D. O'Brien, and C.H. Park. 2007. Rapid detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli by optical immunoassay. J. Clin. Microbiol. 45, 3377-3380 https://doi.org/10.1128/JCM.00837-07
  17. Verweyen, H.M., H. Karch, M. Brandis, and L.B. Zimmerhackl. 2000. Enterohemorrhagic Escherichia coli infections: following transmission routes. Pediatr. Nephrol. 14, 73-83 https://doi.org/10.1007/s004670050018