강황추출물이 두부 부패미생물과 병원성 미생물에 미치는 항균활성

Antimicrobial Activity of Turmeric(Curcuma aromatica Salab.) Extracts Against Various Pathogens and Spoilage Bacteria Isolated from Tofu

Abstract

강황 에탄올 추출물은 Listeria monocytogenes ATCC 19115, Pseudomonas fluorescens ATCC 21541, Staphylococcus aureus ATCC 29273, Salmonella typhimurium ATCC 21541, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 그리고 Aeromonas hydrophila KCTC 2358에 대하여 0.05-0.2% 범위에서 뚜렷한 성장억제효과를 나타내었다. 부패한 두부에서 분리한 4종의 Bacillus sp. 에 대해 강황 에탄올 추출물은 항균활성을 나타내어 Bacillus sp. KN-4와 KN-6의 성장은 0.05% 이상 첨가시 약 2 log cycle 정도 억제되었고, B. licheniformis KN-10은 0.1% 이상 첨가시, Bacillus sp. KN-20의 경우 0.05% 이상 첨가시 배양 12시간 이후부터 뚜렷한 성장 억제 효과가 나타났다. 공시균주에 대한 강황 에탄올 추출물의 최소저해농도(MIC)는 L. monocytogenes는 0.1%, P. fluorescens, S. aureus, S. typhimurium, V. parahaemolyticus, A. hydrophila는 0.3% 그리고 Bacillus sp. KN-4, KN-6, KN-20의 경우 0.2%, B. licheniformis KN-10의 경우 0.25%로 나타났다. 열처리한, 강황 에탄올 추출물의 공시균주에 대한 항균활성은 소실되지 않아 열에 안정한 것으로 나타났다.

The antimicrobial activity of Curcuma aromatica Salab. was investigated. The Curcuma aromatica Salab. extract showed antimicrobial activity against six pathogens tested. These were Listeria monocytogenes ATCC 19115, Pseudomonas fluorescens ATCC 21541,Staphylococcus aureus ATCC 29273, Salmonella typhimurium ATCC 21541, vibrio parahaemolyticus ATCC 17802, and Aeromonas hydrophila KCTC 2358. Antimicrobial activity was alsonoted when the extract was tested against four isolates of Bacillus sp. purified from spoiled tofu. The growth of various pathogens was significantly inhibited (100 10,000-fold) upon growth in tryptic soy broth containing 0.05 0.2%(w/v) Curcuma aromatica Salab. extract(CE), after incubation for 12hr at $37^{\circ}C$. The growth of the four Bacillus isolates was also significantly inhibited in nutrient broth containing 0.05 0.2% CE after incubation for 24hr at $37^{\circ}C$. Although the antimicrobial activity of CE was decreased by heat treatment at temperatures above $80^{\circ}C$, the activity remained relatively high after heat treatment at $121^{\circ}C$ for 15min. The minimum inhibitory concentrations of CE were 0.1 0.3%(v/v culture) for the six pathogens, and 0.2 0.25% for the Bacillus isolates, respectively.

서 론

미생물에 의한 식품의 부패와 식중독의 발생은 식자원의 낭비와 나아가 국민보건을 위협할 수도 있다. 최근 일반인들의 관심이 웰빙, 유기농, 방부제 무첨가 식품, 천연식품등으로 집중되어 오랫동안 식품의 부패방지를 위해 사용되고 있던 방법을 탈피하여 천연 방부제 사용이 빠르게 확산되고 있는 추세이다(1). 이에 따라 최근에는 목단피, 회렵,오미자, 소목, 오배자, 가자 등의 한약재를 이용한 천연 항균제 개발에 대한 연구들도 활발하게 진행되고 있다(2-6). 강황은 생강과에 속하며 인도가 원산지 이고 열대아시아 지역에서 재배되는 다년생식물이다. 뿌리는 한약재로서 혈맥을 소통하여 어체(癌微)를 제거하는 활혈화어약(活血化瘀葯)이며, 카레 등 착색성 향신 식품원료, 또는 방향건위(方香健胃), 이담(利轉, 진통제(鎭痛濟) 등 생약으로 사용하는 약용식물이다(7). 강황의 주성분은 향기성분과 curcumincid의 색소 성분으로 나뉘어질수 있는데 강황의 향기성분보다는 curcuminoids에 의한 착색효과가 중요한 것으로 평가되고 있다(8). 최근 강황의 생리활성물질인 curcuminoids의 약리효과가 알려지면서 의학 분야를 중심으로 간장염, 담도염, 담석증, 카타르성 황달, 소화기 및 심혈관계에 대한 작용, 항 혈소판 응집, 혈중 지질 강하, 항산화, 항 돌연변이,항종양, 항균작용 등에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는 실정이다(9-11). 본 실험에서 다양한 생리활성이 있는 강황의 천연 항균성 물질로서의 사용가능성을 검토하기 위해 병원성 미생물과 두부에서 분리한 부패 세균에 대한 항균 활성을 비교 검토하였다.

재료 및 방법

재료 및 추출방법

강황은 대구 약전 골목에서 구입한 것으로 마쇄하여 강황 500 g에 95% 에탄올을 10배 가하여 진탕기 (HANBAK Scientific Co. Korea)를 이용하여 상온에서 150 rpm으로 24시간 동안 진탕시키면서 2회 반복 추출하였다. 추출액을 회수하여 감압농축기(BÜCHI Rotavapcjr R-114, Switzerland)를 사용·농축하였으며, 농축된 추출물을 동결 건조(Dshin lab. PVTFD20R. Korea)하여 냉동보관하며 사용하였다. 강황 열수 추출물의 경우, 강황 500 g에 증류수를 10배 첨가하여 80°C에서 3시간 가열한 후 여과한 다음 강황 에탄올 추출물과 동일한 방법으로 농축 제조하였다.

사용균주 및 배지

강황 추출물의 항균활성 검색을 위히여 Listeria monocytogenes ATCC 19115, Pseudomonas fluorescens ATCC 21541, Staphylococcus aureus ATCC 29273, Salmonella typhimurium ATOC 17802, Vibrio parahaemolyticus ATOC 17802 Aeromonas hydrophila KCTC 2358의 6종의 병원성 미생물과 부패한 두부에서 분리한 Bacillus sp. KN-4, KN-6, KN-20와 Bacillus licheniformis KN-10을 사용하였다(12). 병 원성 균은 tryptic soy agar(TSA, Difco, USA)에 Bacillus sp.는 nutrient agar(N.A, Difco, USA)에 접종하여 각각37°C와 30 & deg; C에서 72시간 배양한 후 4°C에 보관하면서 사용하였다.

항균활성 및 농도별 성장 억제 효과

각각의 공시균주에 대한 강황 에탄올 추출물과 물 추출물의 항균활성은 paper disc method(13)를 사용하여 37° C에서 24시간 배양하면서 clear zone의 생성유무를 확인하였으며, 농도별 성장 억제 효과는 강황 고형분 함량을 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2% 농도로 첨가한 tryptic soy broth(TSB, Difco, USA)와 nutrient broth(NB, Difco, USA)에 공시 병 원성 균과두부 부패균을 각각 접종하여 30°C와 37°C에서 각각 배양하면서 24시간 동안 12시간 간격으로 생균수를 측정하였다(14,15).

최소성장 억제농도 측정

강황 고형분 함량을 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3% 첨가한 tryptic soy agar(TSA)와 nutrient agar(NA, Difco, USA)에 적정온도에서 24시간 배양한 공시 병원성 균주와 두부 부패 균주를 접종하여 각각 30°C와 37°C에서 72시간 배양하여 colony형성을 관찰하였으며 colony가 생성되지 않는 농도를 최소성장 억제농도(MIC)로 하였다(16).

열 안정성 측정

강황 추출물의 열 안정성을 검토하기 위하여 추출물을 각각 80°C, 100°C에서 30분간, 121°C에서 15분간 열처리한 후 paper disc method를 이용하여 공시 병원성 균주와 두부부패 균주에 대한 clear zone의 생성 유무를 확인하였다.

통계분석

통계분석은 SPSS software package(ver. 12,0)를 사용하였으며, 각 처리구간의 유의성 검정은 dimcan’s multiple range test를 이용하여 측정하였다(P<0.05).

결과 및 고찰

강황 추출물의 항균활성

강황 에탄올 추출물과 열수 추출물의 L monocytogenes, P. fluorescens, S. aureus, S. typhimurium, V. parahaemolyticus, A hydrophila의 병원성 미생물 6균주와 부패 두부에서 분리한 Bacillus sp. 4균주에 대한 항균활성은 Table 1에서 보는 바와 같다. 열수 추출물은 전체 공시 균주에 대하여 항균활성을 나타내지 않았으나, 에탄올 추출물의 경우 전체 공시균주에 대해 생육 저해환을 생성하여 뚜렷한 항균활성을 나타내었다. 병원성 미생물에 대한 강황 에탄올 추출물의 생육 저해환은 23-26 mm, 두부 부패 미생물은 11-15 mm를 나타내어 두부 부패 미생물보다 병원성 미생물에 대한 항균활성이 더욱 높게 나타났다. Jang 등(17)은 양하의 근경의 에탄올로 추출물은 B. cereus와 B. subtilis에 대하여 항균활성을 보고하였으며, Kim 등(18)은 마늘 추출물이 B.   subtilis에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다고 보고하였고, Lee 등(19)은 울금 에탄올 추출물이 L. mowocytogeraes와 S. aureus에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다고 보고하였다.

Table 1. Antimicrobial activities of Curcuma aromatica Saiab. extracts against various pathogens Clear zone

강황 추출물의 농도별 생육 저해 효과

강황 에탄올 추출물이 항균활성을 나타낸 6종의 공시병원성 균주에 대하여 추출물의 농도에 따른 항균효과는 Table 2에서 보는 바와 같다. L. monocytogems의 경우 배양 12시간째 강황 에탄올 추출물 0.05-0.2%의 농도에서 대조구에 비하여 약 4-6 log cycle 억제되었으며, 배양 24시간째0.05% 이상의 농도에서 대조구에 비하여 약 2-6 log cycle감소하였으며, 0.2%에서는 성장이 관찰되지 않아 강황 추출물은 L. monocytogems에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다. S. aureus의 경우, 배양 24시간째부터 추출물 0.05-0.1% 농도에서 대조구에 비하여 약 6-7 log cycle 억제되었으며, 배양 24시간째 0.15% 이상의 농도에서 성장을 관찰할 수 없었다.

Table 2. Growth of various patogens in tryptic soy broth containing various concentrations of Curcuma aromatica Salab. extract at 37°C

Lee 등(20)은 S. aureus는 매실 착즙액 1% 첨가구에서 대조구에 비해 뚜렷한 증식 억제 효과가 나타나지 않았다고 보고한 바 있으며 , Negi 등(21)은 curcumin 2.5-5.0 mg/mL 범위의 농도에서 S. aureus 억제한다고 보고하여 본 실험과 유사한 경향을 나타내었다. P. fluorescens의 경우 배양 12시간째부터 배양 24시 간째까지 0.05% 이상의 농도에서 대조구에 비하여 약 4-6 log cycle 억제되어 비교적 높은 항균 활성을 나타내었다. A hydrophila과 S. typhimurium의 경우, 배양 12시간째부터 배양 24시간째 까지 0.05% 이상의 농도에서 약 1-2 log cycle억제되었으며, V. parahaemolyticus의 경우 배양 24시간째 0.05%이상의 농도에서 약 1-3 log cycle 억제되는 경향을 나타내었다. 강황 에탄올 추출물의 황균 활성은 S. typhiumuium, A. hydrophila 그리고 V. parahaemolyticus 보다 L monocytogenes, P. fluorescens와 S.에 대해 더욱 높은 항균활성을 나타내었다. Bhavanishankar와 Srinivasamurthy (22)는 curcumin에서 분리, 동정한 turmeric oil 성분은 antifimgal activity가 있으며 특히, A. flavus의 성장을 억제한다고 보고하였다.

부패 두부에서 분리한 Bacillus sp.에 대하여 강황 추출물의 농도별 성장 억제 효과는 Table 3에서 보는 바와 같다. Bacillus sp. KN-4의 경우 대조구에 비하여 약 2 log cycle정도 억제되는 경향을 나타내었으나, 강황 에탄올 추출물 첨가 농도에 따른 유의적 차이는 관찰되지 않았다. Bacillus sp. KN-6도 Bacillus sp.와 유사한 경향을 나타내었다. Bacillus licheniformis KN-10는 강황 에탄올 추출물 0.05% 첨가시 배양 24시간 이후, 0.1% 이상 첨가구의 경우 배양 12시간째부터 균의 성장이 관찰되지 않았다. Bacillus sp. KN-20의 경우 강황 에탄올 추출물 0.05% 이상 첨가시 배양 12시간째부터 균의 성장이 검출되지 않아 Bacillus licheniformis KN-W과 유사한 경향을 나타내었다. 강황 추출물의 두부 부패 미생물에 대한 억제도는 포자를 형성하는 같은 속의 Bacillus에 대해서도 균주에 따라 항균 활성이 각기 다른 경향을 나타내었다. Kim 등(23)의 두부 부패 미생물에 대한 대황 추출물의 농도가 증가 할수록 두부 부패미생물의 성장이 억제된다는 보고와 본 실험과 유사한 경향을 나타내었다.

Table 3. Growth of Bacillus sp. isolated from spoilage tofti in tryptic soy broth containing various concentrations of Curcuma aromatica Salab. extract at 37°C

추출물의 최소성장억제 농도

병원성 미생물과 Bacillus sp.에 대한 강황 에탄올 추출물의 최소성장억제 농도는 Table 4에 나타내었다. P. fluorescens, S. aureus, S. typhymurium, A. hydrophila, V. parahaemolyticus의 경우 추출물 농도 0.3%에서 성장이 나타나지 않았으며, L monocytogenes의 경우 0.1 %의 농도에서 성장이 나타나지 않아 다른 공시균주에 비하여 다소 낮은 MIC를 나타내었다. 두부 부패 Bacillus sp.에 대한 강황 에탄올 추출물의 최소성 장억제 농도는 Bacillus sp. KN-4, Bacillus sp. KN-6, Bacillus licheniformis KN-10에 대하여 0.20%에서 균의 성장이 관찰되지 않았고, Bacillus sp. KN-20은 0.25%에서 균의 성장이 관찰되지 않았다. Choi(24)는 밤나무잎 추출물 50 ppm의 농도에서 fish meat유래 Bacillus sp.의 성장을 저해한다고 보고하였으며, Amphawan 등(25)은 울금의 주성 분인 turmeric oil은 yeast와 pathogenic molds에 대한 최소저해농도는 경우 0.02-0.09%, curcumin의 경우 모든 공시 균주의 MIC는 공히 1% 이상의 범위를 나타내었다고 보고한 바 있다.

Table 4, Minimum inhibitory concentration of Curcuma aromatica Salab. ehanol extract against various pathogens and Bacillus sp. isolated from tofu

추출물의 열안정성

강황을 식품으로 사용할 경우 공정 중 열처리에 의한 항균활성 변화의 유무를 검토하기 위하여 강황 에탄올 추출물의 열안정성을 측정하였다(Table 5). 강황 에탄올 추출물을 80°C에서 30분간 열처리 후에도 항균활성이 열처리 전과유사한 경향을 나타내었다. 열처리 온도가 증가함에 따라 강황 에탄올 추출물의 생육저해환의 크기가 다소 감소하는 경향을 나타내었으나, 열처리 후에도 항균활성을 나타내어각 공시 균주에 대한 항균활성은 열에 대해 비교적 안정한 것으로 판단되었다. Park 등(16)은 식중독 유래 미생물에 대한 용아초 에탄올 추출물의 항균활성은 열처리 후에도 항균활성을 잃지 않았다고 보고하여 본 실험의 결과와 유사하였다. 

Table 5. Effect of heat treatment on antimicrobial activities of Curcuma aromatica Salab. ehanol extract against Bacillus sp. isolated from commercial tofu and various pathogens

 본 실험의 결과 공시 균주에 대한 강황 에탄올 추출물은 식중독 원인균과 두부 부패 미생물에 대해 뚜렷한 항균 활성을 보였으며 열처리 이후에도 항균활성이 소실되지 않아 현재까지 밝혀진 강황의 생리활성과 항균성 및 고유의 색상 등을 활용한 식품 보존제 및 기능성 첨가제로서의 개발이 가능할 것으로 판단된다.

요 약

강황 에탄올 추출물은 Listeria monocytogenes ATCC 19115, Pseudomonas fluorescens ATCC 21541, Staphylococcus aureus ATCC 29273, Salmonella typhimurium ATCC 21541, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 그리고 Aeromonas hydrophila KCTC 2358에 대하여 0.05-0.2% 범위에서 뚜렷한 성장억제효과를 나타내었다. 부패 한 두부에서 분리 한 4종의 Bacillus sp.에 대해 강황에탄올 추출물은 항균활성을 나타내어 Bacillus sp. KN4와 KN-6의 성장은 0.05% 이상 첨가시 약 2 log cycle 정도억제되었고, B. licheniformis KN-10은 0.1% 이상 첨가시, Bacillus sp. KN-20의 경우 0.05% 이상 첨가시 배양 12시간 이후부터 뚜렷한 성장 억제 효과가 나타났다. 공시균주에 대한 강황 에탄올 추출물의 최소저해농도(MIC)는 L. monocytogenes 0.1%, P. fluorescens, S. aureus, S. typhimurium, V. parahaemolyticus, A. hydrophila는 0.3% 그리고 Bacillus sp. KN-4, KN-6, KN-20의 경우 0.2%, B. licheniformis KN-10의 경우 0.25%로 나타났다. 열처리한 강황 에탄올 추출물의 공시균주에 대한 항균활성은 소실되지 않아 열에 안정한 것으로 나타났다.​​​​​​​