양막 유래 줄기세포의 간세포로의 분화 유도

In Vitro Differentiation of Human Amniotic Membrane-derived Stem Cells into Hepatocyte-like Cells

간질환 환자의 대부분은 간 조직 손상으로 인해 간세포의 재생 능력이 감소한다. 간세포 이식은 이러한 간질환을 치료하는데 있어 혁신적인 방법으로 대두되고 있으나, 여전히 많은 의문과 문제점이 제기되고 있다. 사람의 양막으로부터 얻은 줄기 세포를 이용하여 간세포 분화를 위한 최적의 조건을 알아 보고자 하였다. 세포내 알부민에 대한 면역 화학적 방법, 세포내 글리코겐의 특이 염색법, 세포의 형태적 변화 연구 방법 등을 이용하여 여러가지 배양 조건을 조사한 결과, 배양 접시를 fibronectin으로 coating하고 배양액내에 insulin/transferrin/selenium(ITS)을 첨가하는 것이 양막 줄기세포의 간세포로의 분화에 효과적이었다. 또한 배양액내에 fibroblast growth factor(FGF)-1과 FGF-2를 함께 첨가하는 것이 둘 중 하나만 첨가하거나 첨가하지 않는 것보다 효과적이었다. 한편 분화 배양은 한가지 배양액을 사용한 지속적인 배양법(continuous culture method)보다 배양 조건을 달리하여 두 단계로 배양하는 2단계 배양법(two-step culture method)가 훨씬 효과적이었다. 마지막으로, 기본 배양액에 FGF-2와 FGF-4를 첨가한 조건과 FGF-4와 $TGF-{\alpha}$를 첨가한 조건이 다른 조건 보다 알부민 분비를 많이 하는 것으로 보아 FGF-4가 간세포 분화 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지며 FGF-2 및 $TGF-{\alpha}$ 첨가는 더욱 효과적인 배양 조건으로 관찰되었다. 따라서, 양막에서 유래한 성체 줄기 세포는 적절한 배양 조건이 주어질 때, 간세포로 분화가 가능하며, 분화 과정에서 FGF-4가 주도적인 역할을 하며 FGF-2와 $TGF-{\alpha}$는 상승 효과를 갖는 것으로 사료된다.

This study aimed to find out suitable culture conditions for the differentiation of human amniotic membrane-derived stem cells(HAM) into hepatocyte-like cells. Almost homogenous population of fibroblast-like cells was successfully isolated from the amniotic membrane. In comparison to the non-coated plates and in the absence of insulin/transferrin/selenium(ITS), HAM cultured on the fibronectin-coated plates and in the presence of ITS showed the more intense immunocytochemical staining against the albumin. Addition of both fibroblast growth factor(FGF)-1 and -2 to the differentiation medium gave stronger staining compared to the treatment with FGF-1 or -2 alone. Periodic acid Schiff's base staining of glycogen and morphological turnover of fibroblast-like appearance of HAM into round shape matched the results of immunocytochemical studies. When the efficiency of two-step culture method was examined on the differentiation of HAM into hepatocyte-like cells, all of the results of immunocytochemical staining, periodic acid Schiff's staining and morphological change exhibited effective hepatic differentiation of HAM compared to the continuous culture method. Immunoblot analyses of HAM- conditioned media against the albumin showed that the culture of HAM in the presence of both ITS and fibronectin always gave a stronger staining intensity than those in the absence of them, and that the addition of ether mixture of FGF-4 and either FGF-2 or transforming growth $factor(TGF)-{\alpha}$ to the culture medium significantly enhanced the albumin secretion by HAM. Based on these observations, it is suggested that HAM could differentiate into hepatocyte-like cells under a culture condition consisting of fibronectin and ITS, and addition of FGF-4 with either one of FGF-2 or $TGF-{\alpha}$ could enhance the hepatic differentiation of HAM.