Abstract
A thermophilic microorganism, strain JE 375, which produces a thermostable protease, was isolated from soil and compost in Korea. This gram-positive, rod-shaped, catalase positive, motility positive, and hemolysis ${\beta}$ containing organism was implicated in glucose fermentation, mannitol fermentation, xylose oxidation, aerobic activity and spore formation. The color of the colony was yellowish white. The temperature range for growth at pH 6.5 was between 55 and $70^{\circ}C$, with an optimum growth temperature of $65^{\circ}C$. This result confirmed the strain JE 375 as a thermophilic microorganism. The enzyme was produced aerobically at $65^{\circ}C$ during 20 hr in a medium (pH 6.5) containing 1% trypton. 1% maltose, 0.5% yeast extract and 1% NaCl. The 16S rDNA of strain JE 375 had 97.6% sequence similarity with the 16S rDNA of Bacillus caldoxyloyticus. On the basis of biochemical and physiological properties and phylogenetic analysis, we named the isolated strain as Bacillus sp. JE 375. The thermostable protease from Bacillus sp. JE 375 had been partially purified and characterized. The molecular weight of the enzyme was deduced from SDS-PAGE and gel chromatography as 55 kDa and its optimal temperature was $60^{\circ}C$. The enzyme showed its highest activity at pH 7.5 and was stable from pH 7.0 to 8.0.
전국 각지에서 채집한 토양에서 분리한 25종의 내열성 균주 중 내열성 단백질 기수분해효소 활성을 갖는 균주 strain JE 375를 선별하였다. 본 균주는 gram 양성 간균의 특징을 나타냈으며 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology와 Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria에 준하여 생화학적 특성을 검토한 결과 catalase 양성, 포자형성, motility 양성, glucose 발효, mannitol 발효, xylose 산화, hemolysis ${\beta}$균임을 보아 Bacillus sp.으로 추정 되었다. Strain JE 375의 whole cell fatty acid를 gas chromatography로 분석한 결과 $C_{15:0}$ iso 26.17%, $C_{16:0}$ iso 13.01%, $C_{17:0}$ iso 30.19%로 분석되어 Bacillus 계열로 동정되었다. 16S rDNA sequence분석 결과 strain JE 375는 Bacillus caldoxylolyticus와 sequence가 97.6% 일치하는 유사성을 보였으나 부분적으로 sequence의 차이가 있고 gene bank data base상에서 16S rDNA sequence가 일치하는 균주는 검색되지 않았다. 이 같은 실험 결과에 따라 strain JE 375는 기존에 발표되지 않은 새로운 균주로 판단되어 Bacillus sp. JE 375로 명명하였다. Bacillus sp. JE 375은 tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%, maltose 1%의 배지조성분과 배양 온도 $65^{\circ}C$에서 20시간 동안 배양하였을 때 최대의 단백질 분해 효소를 생산하였다. Bacillus sp. JE 375로부터 단백질 분해 효소를 acetone으로 침전시키고 DEAE-sepharose column chromatography를 통하여 효소를 정제하여 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과 55 kDa 크기의 band를 확인할 수 있었다. 이 효소의 최적 배양 온도는 $65^{\circ}C$이었으며 배지의 최적 pH는 6.5로 나타났다. pH에 대한 안정성은 중성 부근의 pH에서 효소 활성의 안정성이 높게 나타났다. 본 효소의 반응 조건을 검토한 결과 중성 조건에서 안정하였으며, $60^{\circ}C$의 고온에서 활성을 가졌다. 효소 활성은 1 mM $CaCl_2$ 첨가에 의해 증가하였다.