Preparation of Tri-n-alkyl[³²P]phosphine Oxide for latent Treatment of Hepatic Tumors

간암 치료를 위한 P-32 Tri-n-alkyl[³²P]phosphine Oxide의 합성에 관한 연구

서 론

원소 인(P)은 생체 내의 저분자의 중간체나 핵산 등의 구성원소로서 존재하며 유전 현상 및 에너지 중개의 중요한 역할을 하고 있어 P-32, P-33을 이용한 다양한 연구가 가능하다. 특히, β- 방사핵종인 P-32의 이용화합물은 [32P] ATP(Adenosin 5'-[γ-32P]triphosphate),[32P] dCTP(Deocycytidine 5'-[α-32P]triphosphate) 등이 있으며, 생화학적 반응 경로를 알기위한 추적자로서 응용되고 있다.1,2 그 밖에 방사성 동위원소 P-32는 세포조직괴사작용에 이용될 수 있다. 166Ho-Chitosan의암 조직 괴사작용3,4을 나타내는 Ho-166는 β-선 방출핵종으로 βmax에너지는 1.9 MeV이다. P-32는 βmax에너지가 1.72 MeV로 Ho-166과 유사한 특징을 가지며, 생체 내 구성원소서 P-32 응용 연구의 지표가 될 수 있다.5

본 연구는 [32P] H3PO4에 대한 응용연구개발의 일환으로 색전현상 및 방사성치료효과를 갖는 P-32가 표지된 오일형 혈관 조영 의약품(oily lymphographic agent)의 유도체를 합성하는데 목적을 두고 있다. 오일형 혈관 조영 의약품은 대표적으로 LUF(Lipiodol Ultra-Fluid)6,7가 있으며 리피오돌(Lipiodol)이라 일컫기도 한다. 리피오돌은 요오드가 치환된 양귀비씨 오일(Iodinate poppyseed oil)로서 긴 탄화수소를 가지고 있으며, 간암과 같은 종양 조직에 대한 장기 집적 특성을 가지고 있다.8 또한 점도가 높아 동맥의 말초혈관 부위 특히, 암 조직에 영양을 공급하는 혈관을 막아서 암 조직을 괴사시키는 색전현상을 나타내기도 한다. 그 원인은 동맥의 각 분지에서 표면 장력에 의해 많은 혈류가 간동맥에 선택적으로 유입되는 현상인 혈류역학적 현상에 기인한다.9 현재, 색전현상을 응용한 암 치료 방법으로는 항암제와 같이 투여하여 암조직을 괴사시키는 경동맥 화학 색전 요법(TransarterialChemoembolization)이 있으며 방사능 동위원소를 표지시킨 리피오돌을 이용한 간암의 비절제치료 가능성과 안정성 검사의 판단의 연구사례가 있다.10 이러한 리피오돌 유사체는 주로 Iodine-131, Yttrium-90을 표지하여 사용하고 있으나 투과성이 높은 γ선과 에너지가 높은 β선으로 정상세포에도 영향을 미치므로 이에 대한 보완 연구가 필요하다고 할 수 있다(Table 1).

방사성 동위원소 P-32는 암세포괴사에 필요한 적당한 에너지를 갖는 β-붕괴를 하며 최대비정이 780 mg/cm2로 액체인 물 상태에서 약 0.5 cm까지만 영향력을미치고 있다. 색전현상을 나타내는 의약품을 제조하기 위해서는 먼저 혈류역학적 성질에 근거한 점도성이 있는 물질의 제조가 필요하다. 이러한 점에서 리피오돌과 유사성질을 갖는 긴 사슬체를 갖는 화합물의 제조와 이 화합물에 동위원소 P-32를 도입한 리피오돌 유사체를 합성을 하였다. 리피오돌 유사체로서긴 사슬체인을 갖는 화합물은 tri-n-alkylphosphine oxide11,12,13이 있으며, 방사성 동위원소 P-32에 긴 탄화수소를 도입한 tri-n-alkyl [32P]phosphine oxide를 합성하였다.

Table 1.Radioisotopers for nuclear medical treatment

 

실 험

시약 및 재료

방사성 동위원소 P-32는 한국원자력 연구소에서 생산된[32P] H3PO4를 이용하였으며, phosphorus oxychloride(POCl3)는 Fluka제품을, HPLC용 메탄올과 에탄올은 Aldrich제품을 사용하였다. 그 외의 시약들은 분석용 특급시약을 구입하여 사용하였다. 방사성 동위원소를 이용한 실험을 위해 반응 초자 기구는 Aldrich사의 KONTES MICROSCALE GLASSWARE KIT를 이용하여 간이 반자동합성장치를 제작하여 사용하였다. 합성 확인에 사용한 TLC는 Merck사의 Silica gel 60F254를 이용하였으며 발색 기구 및 시약으로는 UV-램프, 닌히드린(Ninhydrin)시약 및 I2를 이용하였다. IR은 Bomen100 FT-IR Spectrophotometer를, NMR은 Varian사의Gemini 200을 이용하였으며 질량분석은 서울대학교기초과학 공동기기기연구원의 고성능 액체 크로마토그래피/질량분석기(EI, FAB)를 이용하였다. 라디오크로마토그램은 Bioscan사의 System 200 imaging scanner와AC-3000을 이용하였다. 양이온 분석을 위해 GBC Scientific Equipment Pty Ltd사(GBC Integra XMZ-Australia)의ICP-AES를 사용했다.

비교물질 Tri-n-alkylphosphine Oxide의 합성

동위원소 도입가능성 및 표지화합물 합성의 비교자료를 얻기 위해 방사성 핵종이 아닌 안정한 동위원소 P-31를 이용하여 비교물질을 합성하였다. 질소기체 분위기하에서 다이에틸에테르(Diethyl ether)용매에 브롬화알킬(Alkyl bromide) 3당량(0.03 mol)과 Mg4 당량(0.04 mol, 0.97 g)을 넣고 0 ℃에서 약 40분 동안 교반을 시켜 Grignard 시약을 제조하였다. 그 후 1당량(0.01 mol, 0.93 ml)에 해당하는 POCl3를 소량씩 첨가하고 0 ℃, 질소분위기 하에서 2 h 동안 반응시킨다. 메탄올로 반응을 중지시킨 후 감압증류하였다. 잔유물에 50 ml의 6 M HCl용액으로 세척을 하고 100 ml의 염화메틸렌(Methylene chloride)를 넣어 유기층을 추출하였다. 10 ml의 0.5 M KMnO4를 이용하여 1회, 40 ml의 12M H2SO4로 1회, 40 ml의 증류수로 3회 세척하였다. 0.1M NaOH로 pH 7로 만든 후 20 ml의 염화나트륨 포화용액으로 2회 세척하였다. 무수 MgSO4를 이용하여 건조시켰으며 감압증류 한 후 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제된 tri-n-alkylphosphine oxide를 얻었다. 이때 수득율은 아래와 같다.

-Tri-n-butylphosphine oxide: yield 16.8%. TLC(THF: Chloroform=1:1): Rf = 0.68. 1H NMR(CDCl3); δ 1.60(m, 18H), 0.94(t, 9H). MS(EI, M+); C12H27OP, cald for 218.18, found 218.12

-Tri-n-hexylphosphine oxide: yield 26.5%. TLC (Chloroform: MeOH=20:1): Rf =0.44. 1H NMR(CDCl3); δ 1.62(t, 6H) 1.27(m, 24H), 0.90(t, 9H). MS(EI, M+); C18H39OP, cald for 302.27, found 302.27

-Tri-n-heptylphosphine oxide: yield 29.9%. TLC(Chloroform: MeOH=20:1): Rf =0.41. 1H NMR(CDCl3); δ 1.63(t, 6H) 1.26(m, 30H), 0.91(t, 9H). MS(EI, M+); C21H45OP, cald for 344.32, found 344.32

-Tri-n-octylphosphine oxide: yield 29.1%. TLC(EA: Hexane=3:1): Rf =0.65. 1H NMR(CDCl3); δ 1.65(t, 6H) 1.27(m, 36H), 0.88(t, 9H). MS(EI, M+); C24H51OP, cald for 386.36 found 386.36

-Tri-n-dodecylphosphine oxide: yield 52.1%. TLC(EA: Hexane=1:5): Rf =0.57. 1H NMR(CDCl3); δ 1.58(t, 6H) 1.28(m, 60H), 0.90(t, 9H). MS(FAB, M++1): C36H76OP, cald for 555.56 found 555.56

[32P] POCl3의 제조

[32P] POCl3의 제조는 Keenan14,15에 의해 제시된 평형상태교환방법을 이용하였다. 차폐제로서는 10 mm아크릴판을 이용하였으며 제작된 Microscale vial에 0.1mCi[32P] H3PO4를 넣고 70 ℃ 조건에서 질소가스를 투입시켜 건조시켰다. 0.4-0.5 ml의 POCl3를 Microscale vial에 넣고 30분간 교반 후 105 ℃에서 24시간 교환반응을 하여 [32P] POCl3를 96%의 수율로 제조하였다.

표지화합물 Tri-n-alkyl[32P]-phosphine Oxide의 합성

교환반응에 의해 [32P] POCl3를 합성을 한 후 실온조건과 질소분위기하에서 다이에틸에테르 용매에 브롬화 알킬 0.85 ml를 녹인 후 Mg 0.1 g을 첨가하여Grignard 시약을 생성하였다. Mg이 완전히 녹은 것을 확인한 후 1 mCi의 [32P] POCl3 0.5 ml를 넣고 0 ℃, Ar조건에서 2 h 동안 반응시킨 후 메탄올로 반응을 중지시켰다. 대기압 하에서 60 ℃ 조건에서 질소가스를 이용하여 용매를 제거하고 1 ml의 6 M HCl로 세정하였다. 염화메틸렌을 소량 넣은 후 0.5 ml의 0.6 M KMnO4와 1 ml의 12 M H2SO4로 1회, 1 ml의 증류수로 3회 세척하였다. 0.5 ml의 0.1 M NaOH로 세척 후2 ml의 염화나트륨 포화용액으로 2회 세척하였다. 유기층에 남아있는 수분과 용매를 제거하기 위해 Microscale vial용 증류장치를 이용하여 용매를 제거하였다. 합성의 확인은 라디오크로마토그램을 이용하였으며, 방사화학적 표지수율은 tri-n-butyl[32P]phosphine oxide의 경우 91.0%, tri-n-octyl[32P]phosphine oxide의 경우 60.0%,tri-n-dodecyl[32P]phosphine oxide의 경우 96.0%이었다.

 

결과 및 고찰

비교 물질의 합성

점도에 따른 혈류역학적 장기 집적특성을 가진 물질을 합성하기 위해 알킬사슬길이가 다른 화합물을 합성해야 한다. 사슬길이는 부틸(butyl), 옥틸(octyl), 도데실(Dodecyl)의 4단위 탄소수를 변화시켜 리피오돌유사체인 tri-n-alkylphosphine oxide의 합성하였다. 모든 반응은 단일 용기 반응으로 진행하였으며, 비교물질의 합성 확인은 1H-NMR, Mass, IR, TLC를 통해 확인하였다. Grignard 반응을 통해 tri-n-alkylphosphine oxide을 합성하는데 반응수율의 변화는 시작물질인 할로겐화알킬의 종류, 반응용기의 밀봉상태, 수분 및 반응온도에 기인한다. 할로겐화알킬 선택에 있어 염소화 알킬(R-Cl)은 온도 변화(20 ℃, 40 ℃, 50 ℃)를 주어도 Grignard반응이 진행되지 않았다. 브롬화 알킬의 경우 낮은 온도에서도 반응이 진행되었으며, 발열반응으로 0 ℃ 조건에서 실험을 진행하였다. 또한, 충분한 불활성기체로 수분접촉을 막지 못하는 경우 반응 수율이 아주 낮았다. POCl3의 알킬화반응도 격렬한 발열반응이므로 0 ℃ 조건에서 소량씩 첨가하여 반응을 진행하였다. 반응시간에 따르는 합성수율(Table 2)을 비교하면 2 h일 때 가장 좋은 합성수율을 확인할 수 있었다. 반응시간이 길어지면 반응물사이에서고형화가 진행되는 것이 관찰되었다. 알킬 사슬의 길이의 변화에 따른 합성 수율을 비교하면 사슬길이가 길어질수록 수율의 증가를 확인할 수 있었다. 이는 사슬의 길이가 길어질수록 극성의 정도가 더 작아짐에 기인한 것인데, 이것은 합성된 화합물을 추출하는 과정에서 세척 용매에 생성된 화합물의 일부가 용해되는 현상에 기인한다고 할 수 있다. 이를 억제하기 위해서 증류수 세척시 포화 NaCl 수용액을 이용하는 염석효과(salting out)를 이용하여 손실되는 양을 줄일 수 있었다.

Table 2.Synthetic yield depending on reaction time

리피오돌의 비중은 1.28이며 25 ℃에서 오스트발트(Ostwald) 점도계를 이용하여 물에 대한 상대점성도[η25 ℃]를 확인한 결과 33.28 mPa·s이었다. Tri-nalkylphosphine Oxide의 비교분석을 한 결과 부틸의 경우 비중이 약 1.03을 나타내었으며 상대점성도[η25 ℃]는 약 14 mPa·s로 액상의 점액성을 확인하였다. 옥틸의 경우 상대비중이 약 1.2로 상대점성도[η25 ℃]가 43mPa·s이었으며 점액성이 큰 액체였으며 도데실의 경우 고체 상태이었다.

[32P] H3PO4 용액 분석

방사능 동위원소 P-32는 32S(n,p)32P 핵반응에 의해 생산되며 최종생산물은 [32P] H3PO4이다.16-18 생산과정에서 존재할 수 있는 다른 이온들은 주로 생산에 이용되는 표적물질, 표적 용기 및 첨가된 화학물질에 의해 나타날 수 있으며 표지화합물을 제작하는 과정에서 방해 요인으로 작용할 수 있다. 따라서 표지화합물의 합성 시[32P] H3PO4의 화학적 순도를 확인해야한다. 확인방법은 습식분석에 의한 음이온 분석과 ICPAES를 이용한 양이온 분석하였다. 원자력연구소에서 생산되는 [32P] H3PO4는 완전히 감퇴된 후 음이온과 양이온을 분석하였다. 음이온 분석결과 Cl-, CN-, 가 존재하였으며 가장 많이 포함하는 이온은 Cl-이온임이 확인되었다. 양이온의 확인은 방사성 붕괴가 검출되지 않은 [32P] H3PO4 용액 1 ml을 20배로 묽혀서 분석을 하였다. 그 결과 Na이 약 10 ppm, Ca이 4 ppm,Al이 4 ppm 그리고 Si 4 ppm으로 나타났다. 분석 결과 나타난 용액 속에 주로 존재하는 이온은 Cl-이온 및 Na+ 이온이며 Cl-이온은 친핵치환 반응을 방해하지 않는 이탈기로 작용하므로 표지화합물 합성 시 문제가 되지 않는다. 원자력연구소에서 생산되는 [32P] H3PO4는 정제 없이 사용이 가능하다는 것이 확인되었다.

Tri-n-alkyl[32P]-phosphine Oxide의 합성

P-32에서 방출되는 β 선원을 차폐하기 위하여 10 mm의 아크릴 판을 설치하였으며 실험실 주변의 오염을 막기 위해 1회용 실험기구를 이용하였다. 교환반응을 이용한 [32P] POCl3의 합성은 반응시간 및 온도가 가장 중요한 요소로 작용한다. 온도가 높거나 반응시간이 길 경우 고형화가 진행되고, 온도가 낮을 경우 교환반응이 진행되지 않았다. 교환여부 확인은 에탄올로 반응을 중지시킨 후 방사능 라디오크로마토그램(Fig. 1)을 이용하였으며 에탄올: 메탄올=1:1 전개용매로 확인한 결과 Rf값은 0.59였다. 최대 교환수율은 Table 3에서 0.3 ml POCl3, 0.1 mCi [32P] H3PO4을 105 ℃에서 24 h 반응시 96%이었다.

Fig. 1.Radio TLC chromatogram of prepared [32P] POCl3 Eluents: CH3OH: C2H5OH=1:1, Rf = 0.59.

Table 3.Exchanging condition and its yield of 32-phosphorous

표지 화합물 제작 시 표지 수율의 변화는 주로 방사성 동위원소의 비방사능의 양과 사용 용매의 초 순수성 등 여러 환경에 따라 변화된다. 사용 방사능동위원소의 한 반감기가 진행된 후 합성하였을 경우 상대적으로 표지수율이 낮았으며, 용매의 순도 또한 큰 영향을 받았다. 표지수율을 높이기 위해 한 반감기가지나기 전의 [32P] H3PO4와 재정제한 다이에틸에테르를 사용하였다. 이와 같은 합성조건에서 시간에 따르는 표지수율은 2 h일 때 최대값이 나왔으며 Fig. 2에서보는 바와 같이 tri-n-butyl[32P]phosphine oxide의 경우91.0%, tri-n-octyl[32P]phosphine oxide의 경우 60.0%,tri-n-dodecyl[32P]phosphine oxide의 경우 96.0%이었다. 사슬길이의 변화에 따르는 규칙적 수득율이 관찰되지 않았다.

Fig. 2.TLC Scanning chromatograms of tri-n-alkyl[32P]-phosphine oxide (a) tri-n-butyl[32P]-phosphine oxide, (b) tri-n-octyl[32P]-phosphine oxide, (c) tri-n-dodecylphosphine oxide

 

결 론

치료용 P-32 표지 화합물 tri-n-alkyl[32P]phosphine oxide를 합성한 결과 그 표지수율은 60%이상이었으며 이에 대한 기초적 자료를 제시하였다. 이 P-32 표지화합물은 혈류역학적 현상에 의한 간암 축척물질로서 알킬 사슬의 변화를 주어 점도 변화를 주었으며 색전현상과 방사능 치료를 병행한 방사색전요법(Transarterial Radioembolization)이라는 새로운 분야의 도입에 그 의의를 두고 있다. 더 나아가 in vivo 및 in vitro 연구가 진행되면 새로운 방사성의약품으로서의 가치를 갖는 표지의약품이 되리라 사료된다.

본 연구는 원자력연구개발과제 중 하나로 이용 연구지원사업의 지원에 의해 수행되었으며, 연구 수행에 도움을 준 원자력의학원 싸이크로트론응용연구실에 감사의 글을 드립니다.