Simultaneous Determination of Phthalates(DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DnOP) by Solid Phase Microextraction-GC/MS

Solid Phase Microextraction-GC/MS에 의한 플라스틱가소제(DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DnOP)의 동시분석

Abstract

A procedure based on solid phase microextraction extraction(SPME)-GC/MS has been developed for the simultaneous analysis of plasticizers. The plasticizers investigated in this study are dimethyl phthalate(DMP), diethyl phthalate(DEP), dibutyl phthalate(DBP), benzylbutyl phthalate(BBP), diethylhexyl phthalate (DEHP), di-n-octyl phthalate(DnOP). The limit of detection(LOD) was 0.163~0.299 with relative standard deciation(RSD) of 5.85~15.80% for these compounds. At water reserviors of Han, Geum, Nakdong and Sumjin rivers, only DBPand DEHP were detected at trace level, 0.192~1.270 ng/ml for DBP and 0.077~1.102 ng/ml for DEHP depending on the river.

SPME-GC/MS법을 사용하여 내분비계 교란물질로 추정되는 플라스틱 가소제류를 동시에 분석할 수 있는 방법을 고안하였다. 본 연구에서 사용한 플라스틱 가소제는 dimethyl phthalate(DMP), diethyl phthalate(DEP), dibutyl phthalate(DBP), benzylbutyl phthalate(BBP), diethylhexyl phthalate(DEHP), di-n-octyl phthalate(DnOP)이었다. 표준 시료에 대한 분석결과에서 검출한계(LOD)는 0.163~0.299 ng/ml, 상대표준편차는(%RSD)는 5.85~15.80이었다. 본 방법을 사용하여 한강, 금강, 낙동강 및 섬진강에서 채취한 시료를 분석한 결과, DBP와 DEHP 만이 4대강 모두에서 미량 검출되었으며, DBP와 DEHP의 농도는 각각 0.192~1.270 ng/ml 및 0.077~1.102 ng/ml 범위를 보였다.

서 론

우리들의 주변에 널리 노출되어있는 각종 산업용 원료물질, 플라스틱 가소제, 살충제, 항 산화제, 유기금속류, 식물성 및 합성 estrogen류, 식품첨가제, poly- chlorinated dibenzo-p-dioxins(PCDDS), poly-chlorinated dibenzo furans(PCDFS) 등은 우리들의 주변에 널리 노출되어 있으며, 체내에 흡수될 경우, 내분비계 교란물질(endocrine disrupters)로 작용하고 있다. 이러한 물질들은 대개 벤젠고리가 있고, 기름에 녹는 성질로 체내의 지방질에 축적되며, 생물학적 활성이 커서 극소량으로도 인체에 큰 영향을 미치기 떄문에 이들의 검출 및 분석이 쉽지 않은 편이다.

최근에, liquid solid extraction-GC/MS법 및 liquid solid extraction과 capillary column-GC/MS 법을 사용하여 내분비계 교란물질들을 분석하고 있다.1,2 2000년, Jara 등은 수질시료 중 phthalate류를 분석하는데 polystyrene을 이용한 solid phase extraction과 LC법을 활용하였고, 2001년 Kambia 등은 di(2-ethylhexyl)phthalate를 분석하는데 HPLC법을 이용하였으며,3,4 2002년, Brossa 등은 수질시료중 내분비계 교란물질의 분석에 solid phase extraction-GC/MS법을 적용한 바 있다.5 또한, 2002년 Koch 등은 사람의 소변시료 중에서 1-2급 phthalate류의 대사량을 분석하는데 electrospray ionization(ESI)/LC/MS법을 사용하였다.6 2002년, Prokpkova 등은 수질시료 중 phthalic acid ester들을 농축하는데 solid phase microextraction(SPME)법을 이용하였고, 같은 해, Petrovic와 공동연구자들은 수질환경시료 중 내분비계 교란물질들을 분석하는데 MS법을 사용한 바 있다.7,8

전처리방법으로는 liquid liquid extraction(LLE), liquid solid extraction(LSE) 및 solid phase extraction(SPE) 등이 알려져 잇지만, 플라스틱가소제의 분석에는 다수의 문헌에서 SPE법이 양호한 것으로 소개되었다. 특히, SPME법은 용매를 사용하지 않아서 상대적으로 깨끗한 크로마토그램을 얻을 수 있고, 또한, 적은 시료를 사용하여 높은 농축효과를 얻을 수 있으므로 SPE법 보다는 한 단계 발전된 방법이다.

Fig. 1.Chemical structures of six phthalates used in this study.

본 연구에서는 플라스틱 가소제로서 체내에 유입되면 내분비계를 교란시키는 물질로 추정되고 있는 6종의 phthalate 즉, dimethyl phthalate(DMP), diethyl phthalate(DEP), dibutyl phthalate(DBP), benzylbutyl phthalate(BBP), diethylhexyl phthalate(DEHP), di-n-octyl phthalate(DnOP)를 SPME-GC/MS 법으로 동시에 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 한다. 따라서 이 물질들을 확인 및 분석하는데 수반되는 일련의 조건들을 추적하여 최적화 한 다음, 본 방법을 한강, 금강, 낙동강 및 섬진강의 정수장에서 채수한 원수시료에 적용함으로써 적합성 여부를 확인하였다.

표준 물질로 사용된 6종의 플라스틱 가소제의 구조식은 Fig. 1에서 보는 바와 같다.

 

실 험

소요 시약

DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP 및 DnOP의 표준용액은 Supelco사의 EPA phthalate ester mixture 원액(2,000 μg/ml each in methanol) 500 μl를 methanol(J.T. Baker사의 크로마토그래피용) 100ml로 희석하여 각 물질의 농도가 10μg/ml되게 만들어 4 ℃에서 보관하였다. 내부표준용액으로는 benzyl benzoate 원액(5,000 μg/ml in methanol) 50 μl를 methanol 10 ml로 희석하여 25μg/ml되게 제조하였다. 증류수는 Water purification system(Milipore, USA)를 통과시켜 18.1 MΩ 이상의 증류수를 매 24시간마다 교환하며 사용하였다.

고정상 흡착제로 사용된 SPME fiber는 Supelco사의 poly-dimethyl-siloxane(PDMS), carbo-wax(CW), di-vinylbenzene(DVB), carbo-xene(CAR) 및 poly-arcylate(PA)를 일정 두께로 코팅한 것이다. Fiber는 사용 전에 각 조건에 맞게 조절하여 fiber로부터 불순물의 탈착이 일어나지 않도록 방지하였다. Table 1에 fiber의 종류와 적용조건을 요약하였다.

Table 1.Conditioning Temperature and Time for Fibers.

기기 기구

Gas Chromatograph는 Varian의 CP 3800 GC로서 온도 프로그램이 가능하고, 전자유량제어용 injector가 장착되어 있다. 시료의 정량주입 및 SPME 전처리를 위해서 Combi-Pal Autosampler(CTC analytics, Swiss)를 사용하였다. Capillary column은 Varian사의 CP Sil-8 CB로 길이가 30 m, 내경이 0.25 mm이었다. Column의 고정상은 0.25 μm 입자로 5% diphenyl과 95% polydimethylsiloxane로 코팅되었으며, 비극성이고 열에 안정하며 방향족 화합물에 선택성을 갖는다. 이 column은 -50 ~320 ℃ 범위의 온도에서 사용이 가능하며, 사용할 때는 미리 300 ℃에서 12시간 이상 가동하여 column으로부터의 손실이 없도록 하였다. 본 실험에 사용된 injector의 조건과 oven의 온도를 Table 2~4에 요약하였다.

Table 2.Injector temperature for SPME fiber

Table 3.Injector split ratio programming on time

Table 4.Carrier gas: He(99.999%), Column flow: 1.2 ml/min(constant flow)

Table 5.Mass spectrometer operation parameters

본 연구에 사용한 mass spectrometer는 ion trap type의 Varian Saturn 2200으로 0~650 Da 범위의 질량분석이 가능하고 electron ionization(EI)을 사용하여 물질을 확인한다. MS의 operation parameter 들은 Table 5에 나타내었다.

그 외 사용된 유리 또는 teflon 재질의 기구들은 사용 전에 methanol로 세척한 후 fume hood에서 건조하여 사용하였다.

실험 방법

SPME법에 의한 농축의 최적화을 위하여, SPME fiber의 흡착능력, 교반속도, 온도 및 시간 등 전처리에 영향을 주는 인자들에 대한 검출세기를 비교‧검토하여 최대 값을 나타내는 조건을 선정하였다. 표준용액 일정량을 분취하여 최적화된 SPME 조건에 따라 전처리하고, 조율된 GC/MS법에 의해 mass spectrum을 구하였다. Mass spectrum을 통하여 물질별로 이온화와 fragmentation에 따른 특성을 규명하고, fragmentation ion에 의해 물질들을 확인한 후, 정량에 필요한 표준 검량선을 작성하였다.

확립된 본 방법을 낙동강, 섬진강, 금강 및 한강의 수질시료에 적용하여 적합성 여부를 확인하였다.

 

결과 및 고찰

전처리 조건

플라스틱 가소제 표준용액(50 ng/ml) 20 ml씩을 여러 개의 vial에 분취한 후 teflon septa가 달린 crimp seal cap으로 밀봉하고 500 rpm으로 교반하면서 각 온도(실온, 50 및 80 ℃) 및 시간(10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 및 90 min)에 따라 PA85 fiber에 흡착된 성분별 검출세기를 측정하였다. Fig. 2~4에서 보는 바와 같이, 6종의 가소제들은 모두 온도와 시간이 증가함에 따라 흡착율도 증가하였으며, 50 ℃, 70분의 조건에서 90% 이상의 흡착율을 나타내었다. 그러나, 그 이후에서는 증가율이 극히 완만하였다. PA85 fiber에 대한 가소제들의 흡착율을 비교하면, 일반적으로 방향족 고리화합물로서 alkyl 사슬이 긴 phthalate 순서, 즉, DEHP>DnOP>DBP>BBP>DEP≥DMP 이었다. SPME에 의한 시료 전처리 메카니즘은 3단계로 구분되는데, 첫번째는 분석대상물이 시료로부터 SPME fiber로 이동되는 과정이며, 두번째는 이동된 분석물이 fiber로 흡착되는 과정이고, 세번째는 흡착된 물질이 열에 의해 탈착되는 과정입니다. 이 과정에서 흡착시간, 온도, 교반강도, fiber의 흡착계수, 흡착능력, 탈착온도, 탈착시 운반가스의 유량 등 많은 인자에 의해 영향을 받게 되므로 다른 시험방법에 비해 Fig. 2~4에서 보는 바와 같이 직선성이 떨어지게 된다. 이 문제점을 줄이기 위해서는 흡착시간 등을 늘리게 되면 직선성을 개선할 수는 있으나 가스크로마토그래프의 분석시간 등을 고려한 최적의 조건을 설정한 결과 논문에서와 같은 분석조건이 설정 되었읍니다.

Fig. 2.Inter-relation of response with time and temperature of DMP and DEP.

Fig. 3.Inter-relation of response with time and temperature of DBP and BBP.

Fig. 4.Inter-relation of response with time and temperature of DEHP and DnOP.

또한 플라스틱 가소제 표준용액(1 ng/ml) 20 ml씩을 택하여 500 rpm으로 교반하면서, 50 ℃, 50분의 실험조건에서 각 fiber(PA85, PDMS100, PDMS30, PDMS7, CAR/PDMS75, CW/DVB65, 및 DVB/CAR/PDMS50/30)에 흡착된 성분별 검출세기를 측정하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이, 가소제들에 대한 각 fiber의 흡착특성을 비교하면, PA85 fiber(polyarcylate를 85 μm 두께로 코팅된 fiber)가 가장 우수하였고 그 다음은 PDMS100 >PDMS30 >CW/DVB65 순서를 보였다. 나머지 PDMS7, CAR/PDMS75 및 DVB/CAR/PDMS50/30은 가소제의 전처리에는 부적격한 fiber임을 알 수 있었다. 특히, CW/DVB65는 극성물질과 친화력이 강하여 DMP와 DEP의 전처리에 선택성을 보이고 있다. 일반적으로 DMP와 DEP가 모든 fiber에 대하여 흡착율이 낮은 이유는 이들 분자들의 상대적으로 높은 극성과 물에 대한 용해도로 인하여 fiber와의 친화력이 약하기 때문이라 생각된다.

Fig. 5.The influence of fiber to detector response.

본 실험을 통하여 SPME fiber는 PA85 fiber, 교반속도는 500 rpm, 온도는 50 ℃, 시간은 70분을 전처리 조건으로 정하였고, 탈착은 예비실험에서 확인 된 295 ℃, 10분으로 정하였다.

물질의 확인

Phthalate는 benzene 고리의 ortho위치에 두개의 carboxyl기가 붙어있고 그 끝에 alkyl 또는 aryl 그룹이 붙어있는 형태이다. 이 화합물들의 대표적인 mass spectrum은 carboxyl기의 양 끝에 붙어있는 alkyl 또는 aryl 그룹이 떨어져 나가고, Fig. 6과 같은 형태의 m/z 149가 기본 피크로 나타난다. 이러한 반응은 aromatic ring에서 인접한 두 그룹에 포함되어 있는 수소의 이동에 의해 “ortho-effect”의 영향으로 나타나게 된다.9 이러한 재배열은 두 개의 작용기가 평면상에 배열되어 있을 경우에 매우 강하게 나타난다. 이와 같은 특징은 방향족 고리에서 ortho 위치와 meta 또는 para 위치에 있는 물질들을 구분하는데 이용된다.

Ortho effect에 의한 배열은 탄소사슬이 길어질수록 강하게 나타나게 된다. 실제로 본 대상물질 중에서도 DMP를 제외한 5종의 물질은 모두 m/z 149에서 기본 피크가 나타나는 것을 Fig. 7에서 확인할 수 있다.

Fig. 6.General fragmentation of phthalate.

Fig. 7.E.I. Mass spectrum of six phthalate compounds.

DMP에서는 다른 phthalate와는 다르게 Fig. 8과 같이, 한 개의 methoxy기가 떨어져 나가는 반응에 의해 생성된 m/z 163이 기본 피크로 나타나는 것이 관측되었다.

그 외 DEP의 경우에는 Fig. 9와 같이 분자량 피크인 m/z 223 피크와 ethyl기가 떨어지고 [H+]가 첨가되어 m/z 177 피크가 나타났고, BBP에서는 Fig. 10과 같이 m/z 149 외에 benzyl 그룹에 의한 m/z 91 피크, benzyl 그룹의 이탈에 의해 생성된 m/z 223 피트, 그리고 butyl 그룹의 이탈에 의해 생성된 m/z 251 피크를 확인할 수 있었다.

Fig. 8.Fragmentation of dimethyl phthalate.

Fig. 9.Fragmentation of Diethyl phthalate.

Fig. 10.Fragmentation of Benzylbutyl phthalate.

Fig. 11.Fragmentation of Diethylhexyl phthalate.

또한 DEHP에서는 Fig. 11과 같이 하나의 ethylhexyl 그룹이 이탈하여 생성된 m/z 279 피크와 두 개가 이탈하여 생성된 m/z 167 피크가 관측되었다.

6종의 플라스틱 가소제 혼합용액을 본 방법에 따라 분리한 결과는 Fig. 12에서 보는 바와 같다. Chromatogram b에서는 DMP의 특성 이온인 m/z 163을, 또 c에서는 나머지 phthalate의 특성 이온인 m/z 149 만을 추출하여 식별을 용이하게 하였다.

Fig. 12.Chromatogram of six phthalate compounds. (a) total ion count (TIC) chromatogram of phthalate, (b) extracted ion chromatogram m/z 163 for dimethyl phthalate and (c) extracted ion chromatogram m/z 149 for other phthalate.

표준 검량선

플라스틱 가소제 표준용액 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ng/ml 씩을 취하여 50 ℃에서 500 rpm으로 교반하면서 70분 동안 PA85 fiber로서 농축시킨 후, 검토된 GC 및 MS의 조건에 따라 처리한 결과를 이용하여 작성한 검량선은 Fig. 13~15에서 보는 바와 같다. 일반적으로, 표준물질의 희석과정에서 발생하는 불확정성을 고려한다면 작성한 검량선은 좋은 직선성을 나타낸다고 할 수 있다. 또한 1 ppb에 해당되는 시료용액을 대상으로 본 방법을 적용하여 5회 반복실험하였다. 그 결과를 Table 6에 요약하였다.

Fig. 13.Calibration curves of DMP and DEP.

Fig. 14.Calibration curves of DBP and BBP.

Fig. 15.Calibration curves of DEHP and DnOP.

Table 6에 요약된 바와 같이, DMP는 가장 낮은 표준편차(0.054 ng/ml)와 검출한계(0.163 ng/ml)를, DnOP는 가장 높은 표준편차(0.100 ng/ml) 및 검출한계(0.299 ng/ml)를 나타내었다.

Table 6.Standard Deviation and Detection Limit for Phthalates.

시료 분석

시료는 낙동강, 섬진강, 금강, 한강 등 4대 강의 정수장에서 수계별로 3~5 지점을 택하여 원수 2 l씩 채수한 후 갈색 유리병에 담아 4 ℃의 냉암소에 보관하고, 이들 시료 중에 함유된 플라스틱 가소제를 본 방법에 따라 분석하였다. 그 결과를 Table 7에 요약하였다.

Table 7.Analysis of Phthalates in Water Samples of Han, Geum, Nakdong and Sumjin Rivers

Table 7에 나타난 결과를 보면, DBP와 DEHP는 4대강 모두에서 검출되었으나 다른 phthalate류는 검출되지 않았다. 낙동강의 원수 중 DBP와 DEHP의 평균값은 0.48과 0.08 ng/ml이었고 섬진강의 원수 중에 존재하는 DBP와 DEHP의 평균값은 0.60와 0.42 ng/ml이었다. 그리고, 한강의 원수에 존재하는 DBP와 DEHP의 평균값은 1.27와 1.10 ng/ml이고, 금강의 경우는 DBP와 DEHP의 평균값이 0.19와 0.61 ng/ml를 보였다.

 

결 론

Solid phase microextraction(SPME)법에 의한 phthalate류의 전처리 시, 50 ℃, 500 rpm에서 70분 동안에 PA 85 fiber에 의하여 phthalate 류가 90% 이상 흡착되었다. Mass spectrum을 통해 확인한 결과, 각 물질 별 fragmentation ion의 m/z은 다음과 같다: DMP; 163, DEP; 149, 177, 223, DBP; 149. 223, BBP; 91, 149, 223, 251, DEHP; 149, 167, 279, DnOP; 149, 279. 각 물질 별 검량곡선은 선형계수가 0.934~0.972로 직선성을 잘 나타내고 있으며, 상대표준편차(RSD)는 5.4~9.5%이고 검출한계(LOD)는 0.163~0.299 ng/ml로서 이들의 동시분석이 가능하였다.

낙동강, 섬진강, 한강 및 금강의 오염실태를 보면, DBP와 DEHP는 4대강 모두에서 검출되었으나 다른 phthalate류는 검출되지 않았다. DBP와 DEHP 모두 한강에서 최대(1.27 ng/ml 및 1.10 ng/ml)로 검출되었으며, DEP는 금강에서 최소(0.19 ng/ml)로 그리고 DEHP는 낙동강에서 최소(0.08 ng/ml)로 검출되었다. 특히, DEHP의 경우 WHO의 음용수 지침 값인 8 ng/ml와 비교하면, 현재의 수계별 오염값은 미소한 양이라고 하겠지만, 4대강 모두에서 검출되고 있음을 감안하면, 지속적인 조사와 감시가 필요하다.

본 분석방법은 신속성에 있어 앞으로 다양한 환경에서의 수질 분석에 크게 활용될 것으로 사료된다.