Korean Journal of Microbiology (미생물학회지)
- Volume 39 Issue 4
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- Pages.216-222
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- 2003
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- 0440-2413(pISSN)
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- 2383-9902(eISSN)
High-level Expression of Human Procaspase-9 in Escherichia coli and Purification of its GST-tagged Recombinant Protein
대장균을 이용한 세포사멸 유도 단백질 caspase-9의 발현에 관한 연구
- Seong, Yeong-Mo (Graduate School of Biotechnology, Korea University) ;
- Han, Cheol (Graduate School of Biotechnology, Korea University) ;
- Choe, Ju-Yeon ;
- Park, Hyo-Jin (Graduate School of Biotechnology, Korea University, Department of Biology, Sangmyung University) ;
- Seong, Geun-Hye (Graduate School of Biotechnology, Korea University) ;
- Nam, Min-Gyeong (Research Institute of Molecular Genetics, Catholic Research Institutes of Medical Sciences,The Catholic University of Korea) ;
- Kim, Sang-Su (Research Institute of Molecular Genetics, Catholic Research Institutes of Medical Sciences,The Catholic University of Korea) ;
- Kim, In-Gyeong (Biochemistry, College of Medicine, The Catholic University of Korea) ;
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Gang, Seong-Man
(Graduate School of Biotechnology, Korea University) ;
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Im, Hyang-Suk
(Research Institute of Molecular Genetics, Catholic Research Institutes of Medical Sciences,The Catholic University of Korea)
- 성영모 (고려대학교 생명공학원) ;
- 한철 (고려대학교 생명공학원) ;
- 최주연 (가톨릭대학교 의과학연구원 분자유전학연구소, 상명대학교 생물학과) ;
- 박효진 (고려대학교 생명공학원, 상명대학교 생물학과) ;
- 성근혜 (고려대학교 생명공학원) ;
- 남민경 (가톨릭대학교 의과학연구원 분자유전학연구소) ;
- 김상수 (가톨릭대학교 의과학연구원 분자유전학연구소) ;
- 김인경 (가톨릭대학교 의과대학 생화학교실) ;
-
강성만
(고려대학교 생명공학원) ;
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임향숙
(가톨릭대학교 의과학연구원 분자유전학연구소)
- Published : 2003.01.01
Abstract
Human caspase-9, an essential apoptosis initiator protease, was excessively degraded when expressed in Escherichia coli under the conventional induction condition. To optimize the conditions for induction and develop a rapid purification method for obtaining significant amounts of wild-type procaspase-9, we expressed procaspase-9 as GST fusion in E. coli. The addition of 0.01 mM IPTG as an inducer to the bacterial culture and decreasing the culture temperature to 25oC improved the production of procasapse-9 protein by circumventing proteolytic degradation in E. coli. The wild-type procaspae-9 was purified to approximately 70% purity with relatively high yields using the method developed in this study. In addition, we found that GST-caspase-9 is autocatalytically cleaved after aspartic acid 315, which is the same site for processing in mammalian cells, during expression in E. coli.
Caspase는 세포사멸 과정에서 중심적 역할을 하는 cysteine 단백분해 효소이다. 그 중 caspase-9은 활성이 없는 전장 단백질로 존재하지만 Apaf-1과 cytochrome c와 함께 apoptosome을 이루면 활성화된다. 활성 된 caspase-9은 다른 caspase들을 활성 시키는 중요한 기능을 갖는다. 본 연구에서는 대장균에서 전장 caspase-9 단백질을 정제하고자 pGEX 발현 시스템을 이용하였다. 그러나 일반적 배양 및 유도조건에서 caspase-9을 발현시키면 과다한 단백분해로 인하여 전장 caspase-9 단백질이 매우 적게 발현되었다. 이를 극복하기 위해 배양조건과 유도인자의 농도를 변화시키자 caspase-9의 과다한 단백분해 현상이 감소되고 전장 caspase-9의 발현 정도도 상당량 향상되었다. 본 연구에서 확립된 배양조건으로 caspase-9을 발현, 정제하면 70%이상의 순도를 가진 GST-caspase-9 단백질을 손쉽게 얻을 수 있다. 더불어 GST 융합 caspase-9이 대장균에서 발현될 때도 포유세포 내에서 절단되는 것과 동일한 위치인 Asp315 에서 자가 단백분해 반응이 일어난다는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 caspase-9의 생화학적, 세포생물학적 기능연구에 필요한 전장 단백질을 다량으로 확보할 수 있는 간단하고 효과적인 정제방법을 제안한다.