The Effect of Surfactant on Neutrophil Apoptosis in Lipopolysaccharide Induced Acute Lung Injury in Rat

기관내 내독소 투여로 유도한 백서의 급성 폐손상 모델에서 surfactant가 호중구의 아포토시스에 미치는 영향

Background : The therapeutic effects of surfactant on acute lung injury derive not only from its recruiting action on collapsed alveoli but also from its anti-inflammatory effects. Pro-apoptotic action on alveolar neutrophils represents one of the important anti-inflammatory mechanisms of surfactant. In the present study, we evaluated the effects of sufactant on the apoptosis of human peripheral and rat alveolar neutrophils. Methods : In the (Ed- the article is not definitely needed but it helps to separate the two prepositions 'in') in vitro study, human neutrophils were collected from healthy volunteers. An equal number of neutrophils ($1{\times}10^6$) (Ed-confirm) was treated with LPS (10, 100, 1000ng/ml), surfactant (10, 100, $1000{\mu}g/ml$), or a combination of LPS (1000ng/ml) and surfactant (10, 100, $1000{\mu}g/ml$). After incubation for 24 hours, the apoptosis of neutrophils was evaluated by Annexin V method. In the in vivo study, induction of acute lung injury in SD rats by intra-tracheal instillation of LPS (5mg/kg) was followed by intra-tracheal administration of either surfactant (30mg/kg) or normal saline (5ml/kg). Tenty-four hours after LPS instillation, alveolar neutrophils were collected and the apoptotic rate was evaluated by Annexin V method. In addition, changes of the respiratory mechanics of rats (respiratory rate, tidal volume, and airway resistance) were evaluated with one chamber body plethysmography before, and 23 hours after, LPS instillation. Results : in the in vitro study, LPS treatment decreased the apoptosis of human peripheral blood neutrophils (control: $47.4{\pm}5.0%$, LPS 10ng/ml; $30.6{\pm}10.8%$, LPS 100ng/ml; $27.5{\pm}9.5%$, LPS 1000ng/ml; $24.4{\pm}7.7%$). The combination of low to moderate doses of surfactant with LPS promoted apoptosis (LPS 1000ng/ml + Surf $10{\mu}g/ml$; $36.6{\pm}11.3%$, LPS 1000ng/ml +Surf $100{\mu}g/ml$; $41.3{\pm}11.2%$). The high dose of surfactant ($1000{\mu}g/ml$) decreased apoptosis ($24.4{\pm}7.7%$) and augmented the anti-apoptotic effect of LPS (LPS 1000ng/ml + Surf $1000P{\mu}g/ml$; $19.8{\pm}5.4%$). In the in vivo study, the apoptotic rate of alveolar neutrophils of surfactant-treated rats was higher than that of normal saline-treated rats ($6.03{\pm}3.36%$ vs. $2.95{\pm}0.58%$). The airway resistance (represented by Penh) of surfactant-treated rats was lower than that of normal saline-treated rats at 23 hours after LPS injury ($2.64{\pm}0.69$ vs. $4.51{\pm}2.24$, p<0.05). Conclusion : Surfactant promotes the apoptosis of human peripheral blood and rat alveolar neutrophils. Pro-apoptotic action on neutrophils represents one of the important anti-inflammatory mechanisms of surfactant.

연구배경 : 급성폐손상에서 표면활성물질의 치료효과는 허탈된 폐포를 재환기시키는 작용 외에 표면활성물질이 지닌 항염증효과도 기여하는 것으로 알려져있다. 표면활성물질의 항염증효과의 기전에 호중구의 아포토시스를 촉진하는 작용이 관련되어 있을 가능성이 있다. 본 연구에서는 사람의 말초혈액 호중구와 LPS로 급성폐손상을 유발한 흰쥐의 폐포내 호중구의 아포토시스에 대하여 표면활성물질이 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 방 법 : 생체외 실험에서는 자원자의 혈액에서 호중구를 분리하여 같은 수의 호중구 ($1{\times}10^6$)에 LPS(10, 100, 1000ng/ml), surfactant(10, 100, 1000${\mu}g$/ml), 그리고 LPS(1000ng/ml)와 표면활성물질(10, 100, 1000${\mu}g$/ml)을 혼합하여 투여하였다. 24 시간 배양한 후에 호중구의 아포토시스를 Annexin V 방법을 이용하여 분석하였다. 생체내 실험에서는 백서의 기관 내로 LPS(5mg/kg)를 투여하여 급성폐손상을 유발한 후에, 한 군은 표면활성물질(30mg/kg)을 다른 군은 생리식염수(5ml/kg)를 30 분 후에 기관 내로 투여하였다. LPS 투여 24 시간 후에 기관지폐포세척술을 시행하여 기관지폐포세척액을 얻었으며, 여기에서 호중구를 분리하여 Annexin V 방법으로 아포토시스를 측정하였다. 또한 LPS 투여 전과 23 시간 후에 one chamber body plethy smography를 이용하여 호흡역학(일호흡량, 호흡수, Penh)의 변화를 측정하였다. 결 과 : 생체외 실험에서 LPS 투여는 사람 말초혈액 호중구의 아포토시스를 억제하였다(대조군; $47.4{\pm}5.0%$, LPS 10ng/ml; $30{\pm}10.9%$, LPS 100ng/ml; $27.5{\pm}9.5%$, LPS 1000ng/ml; $24.4{\pm}7.7%$). 낮은 농도의 표면활성물질 투여는 LPS 투여에 의해 억제 되었던 호중구의 아포토시스를 촉진시켰다(LPS 1000ng/ml=Surf 10${\mu}g$/ml 1; $36.6{\pm}11.3%$, LPS 1000ng/ml+Surf 100${\mu}g$/ml 1; $41.3{\pm}11.2%$). 높은 농도의 표면활성물질($1,000{\mu}g/ml$) 투여는 그 자체도 호중구의 아포토시스를 억제할 뿐만 아니라($24.4{\pm}7.7%$) LPS의 항아포토시스 작용을 촉진하였다(LPS 1000ng/ml+Surf $1000{\mu}g/ml$; $19.8{\pm}5.4%$). 생체내 실혐에서 표면활성물질 투여는 생리식염수 투여에 비해서 급성폐손상을 받은 쥐에서 기관지 폐포세척액의 호중구의 아포토시스를 촉진하였다($6.03{\pm}3.36%$ vs $2.95{\pm}0.58%$). 표면활성물질을 투여한 백서는 생리식염수를 투여한 백서에 비해 LPS 자극 후 23 시간에 측정한 기도저항(Penh) 이 낮았다($2.64{\pm}0.69$ vs $4.51{\pm}2.24$, p<0.05). 결 론 : 이상의 결과로 표면활성은 사람의 말초혈액 호중구와 급성폐손상을 받은 백서의 기관지폐포세척액 내의 호중구의 아포토시스를 촉진하며, 이런 효과가 표면활성불질의 항염증효과의 기전 중 하나일 것으로 추측된다.