Escherichia coli WC7가 생산하는 Phytase의 효소특성과 그 유전자의 클로닝

Characterization and Cloning of a Phytase from Escherichia coli WC7.

  • 최원찬 (한국생명공학연구원 미생물유전체 연구실) ;
  • 오병철 (한국생명공학연구원 미생물유전체 연구실) ;
  • 김형권 (한국생명공학연구원 미생물유전체 연구실) ;
  • 강선철 (대구대학교 공과대학 생물공학과) ;
  • 오태광 (한국생명공학연구원 미생물유전체 연구실)
  • 발행 : 2002.03.01

초록

토양으로부터 phytate 분해능이 뛰어난 phytate를 생산하는 균주를 분리 동정한 결과 Escherichia coli로 동정되었고, E. coli WC7으로 명명하였다. 이 균주가 생산하는 phytase를 ammonium sulfate 침전, Phenyl-Sepharose, DEAE-Sepharose, CM-Sepharose, Resoure S, Mono S 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리정제를 수행하여 정제도 1,250 배, 수율 30%로 정제하였고 640 Unit/mg의 비활성을 얻었다. 또한 정제된 phytase는 SDS-PAGE에서 분자량 45kDa인 단일 subunit로 이루어진 단일효소임을 확인하였다. E. coli WC7 phytase의 최적 pH는 5.0, 최적 온도는 $60^{\circ}C$였으며, pH 2.0-12까지 안정하였다. 열안정성에서는 $60^{\circ}C$이상에서 급격한 활성의 감소를 보여 초기 활성의 20% 활성만을 나타내었다. Phytase의 N-말단 아미노산 서열은 Ser-Glu-Pro-Clu-Leu-Lys-Leu-Glu-Ser-Val-Val이었으며 이는 E. coli 유래의 pH 2.5 acid phosphatase와 아주 큰 유사성을 보였다. S. coli WC7 phytase의 유전자를 확보하기 위해 E. coli acid phosphatase의 DNA sequence를 바탕으로 한 primer들을 이용하여 PCR 클로닝을 수행하였으며 증폭된 PCR fragment를 pUC19 벡터에 클로닝 하고 DNA 염기서열을 결정하였다. 그 결과 1.2 kbp의 WC7 phytase 유전자의 ORF를 확인하였으며 432개의 아미노산으로 이루어진 분자량 44,716 Da의 단백질을 확인 할 수 있었다. 대부분의 acid phosphatase 효소들의 active site라고 추정되는 active site motif인 RHGXRXP가 N-terminal 쪽에 존재하고 있었다. pUEP를 이용하여 E. coli XL1-Blue에서 phytase를 발현시켰을 때 효소의 생산량이 17.5 U/ml로서 원균주의 23배 활성을 가졌으며,효소의 비활성 및 pH 안정성 측면에서 높은 산업적 이용가능성을 볼 때 사료첨가제 효소로의 개발을 기대할 수 있을 것이라 판단된다.

Phytase from Escherichia coli WC7 was purified from cell extracts and its molecular mass was estimated to be 45 kDa by SDS-PAGE. Its optimum temperature and pH for phytate hydrolysis was 6$0^{\circ}C$ and pH 5.0, respectively. The enzyme was stable up to 6$0^{\circ}C$ and over broad pH range (pH 2-12). The enzyme had higher affinity for sodium phytate than p-nitrophenylphosphate (pNPP). That is, the apparent Km value for sodium phytate and pNPP were $0.15\pm$0.02 mM and 2.82$\pm$0.05 mM, respectively. The gene encoding the phytase was cloned in E. coli XL1-Blue. Sequence analysis showed an open reading frame of 1241 Up encoding a signal peptide (22 aa) and a mature enzyme (410 aa). WC7 phytase was expressed up to 17.5 U/ml in the transformed E. coli XL1-Blue/pUEP, which was 23-fold higher than the activity from wild strain.

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참고문헌

  1. Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
  2. Elie Dassa, M. C. and P.L. Boquet. 1982. The acid phosphatasewith optimumpH of 2.5 of Escherichia coli. J Bioi. Chem. 257: 6669-6676.
  3. Gibson, D. 1987. Production of extracellular phytase from Aspergillus ficuum on starch media. Biotechnol. Lett. 9: 305-310.
  4. Greiner, R., U. Konietzny, and K. D. Jany, 1993. Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli. Arch Biochem Biophys. 303: 107-113.
  5. Kim, Y. -H., S. Y. Yang, D. Y. Kim, C. W. Kim, W.H. Jung, M. N Gwon, and M. D. Song. 2001. Isolation of Enterobatter cloacae producing phytase and medium optimization of its production. Kor. J Appl. Microbiol. Biotechnol. 29: 78-83.
  6. Kim, Y. O. and H. K. Kim. 1998. Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus. sp DS11. Enzym. Microb. Technol. 22: 2-7.
  7. Kim, Y. O., J. K. Lee, H. K. Kim, J. H. Yu, and T. K. Oh. 1998. Cloning of the thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 162: 185-191.
  8. Krieg, N. R. and J. G. Halt. 1984. Bergey's manual of systematic bacteriology. Vol. 1, Williams and Wilkins, Baltimore, MD.
  9. Oh, B. C., B. S. Chang, K H. Park, N. C. Ha, H. K Kim, and T. K Oh. 2001. Calcium-dependent catalytic activity of a novel phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11. Biochemistry40: 9669-9676.
  10. Powar, V K and V Jagannathan. 1982. Purification and properties of phytate-specific phosphatase from Bacillussubtilis. J Bacteriol 151: 1102-1108.
  11. Rackis, J. J. and , R. L. Anderson. 1977. Mineral availability in soy protein products. Food. prod. Dev. 11: 38.
  12. Rodriguez, E.,Y Han, and X. G. Lei. 1999. Cloning, sequencing, and expression of an Escherichia coli acid phosphatase/ phytase gene (appA2) isolated from pig colon. Biochem Biophys Res Commun 257: 117-123.
  13. Shieh, T. R. and J. H. Ware. 1968. Survey of microorganism for the production of extracellular phytase. Appl Microbiol 16: 1348-1351.
  14. Shimizu, M. 1992. Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56: 1266-1269.
  15. Touati, E., A. Danchin. 1987. The structure of the promoter and amino terminal region of the pH 2.5 acid phosphatase structural gene (appA) of E. coli: a negative control of transcription mediated by cyclic AMP. Biochimie 69: 215-221.
  16. Ullah, A. H. and H. C. Dischinger, Jr. 1995. Aspergillus fieuum phytase active site: involvement of Arg and Trp residues. Ann. N. Y. Acad. Sci. 750: 51-57. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.1995.tb19924.x
  17. Wodzinski, R. J. and A. H. Ullah. 1996. Phytase. Adv. Appl. Microbiol. 42: 263-302.
  18. Yamada, K, Y. Minoda,and K Yamada. 1968.Phytasefrom Aspergillus terreus. Part 1. Production, purification, and some general properties of the enzyme. Agric. Biol. Chem. 32: 1275-1283.
  19. Yoon, S. J. and Y. J. Choi. 1996. Isolation and identification of phytase-producing bacterium, Enterobacter sp. 4, and enzymatic properties of phytase enzyme. Enzyme Microb. Technol. 101: 449--454.