Abstract
Background : NF-${\kappa}B$ is the most important transcriptional factor in IL-8 gene expression. Triptolide is a new compound that recently has been shown to inhibit NF-${\kappa}B$ activation. The purpose of this study is to investigate how triptolide inhibits NF-${\kappa}B$-dependent IL-8 gene transcription in lung epithelial cells and to pilot the potential for the clinical application of triptolide in inflammatory lung diseases. Methods : A549 cells were used and triptolide was provided from Pharmagenesis Company (Palo Alto, CA). In order to examine NF-${\kappa}B$-dependent IL-8 transcriptional activity, we established stable A549 IL-8-NF-${\kappa}B$-luc. cells and performed luciferase assays. IL-8 gene expression was measured by RT-PCR and ELISA. A Western blot was done for the study of $I{\kappa}B{\alpha}$ degradation and an electromobility shift assay was done to analyze NF-${\kappa}B$ DNA binding. p65 specific transactivation was analyzed by a cotransfection study using a Gal4-p65 fusion protein expression system. To investigate the involvement of transcriptional coactivators, we perfomed a transfection study with CBP and SRC-1 expression vectors. Results : We observed that triptolide significantly suppresses NF-${\kappa}B$-dependent IL-8 transcriptional activity induced by IL-$1{\beta}$ and PMA. RT-PCR showed that triptolide represses both IL-$1{\beta}$ and PMA-induced IL-8 mRNA expression and ELISA confirmed this triptolide-mediated IL-8 suppression at the protein level. However, triptolide did not affect $I{\kappa}B{\alpha}$ degradation and NF-$_{\kappa}B$ DNA binding. In a p65-specific transactivation study, triptolide significantly suppressed Gal4-p65T Al and Gal4-p65T A2 activity suggesting that triptolide inhibits NF-${\kappa}B$ activation by inhibiting p65 transactivation. However, this triptolide-mediated inhibition of p65 transactivation was not rescued by the overexpression of CBP or SRC-1, thereby excluding the role of transcriptional coactivators. Conclusions : Triptolide is a new compound that inhibits NF-${\kappa}B$-dependent IL-8 transcriptional activation by inhibiting p65 transactivation, but not by an $I{\kappa}B{\alpha}$-dependent mechanism. This suggests that triptolide may have a therapeutic potential for inflammatory lung diseases.
연구배경 : 폐상피세포가 능동적으로 IL-8을 분비한다는 것은 주지의 사실이다. NF-${\kappa}B$는 IL-8 발현 조절에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하는 전사인자이다. Triptolide는 최근 밝혀진 NF-${\kappa}B$ 억제제로서 중국한약제인 뇌공등 (Tripterygium Wilfordii)에서 추출된약제이다. 연자들은 새로운 NF-${\kappa}B$ 억제제인 triptolide가 폐상피세포에서 NF-${\kappa}B$ 의존성 IL-8 유전자의triptolide가 염증성 폐질환에서 새로운 치료제로서의 가능성을 확인하기 위하여 본 연구를 시행하였다. 방법 : 폐상피세포로서 A549 사용하였고 triptolide는 미국의 Pharamagenesis(Palo Alto, CA)사로부터 제공받았다. NF-${\kappa}B$ 활성유도물질로는 IL-$1{\beta}$(R&D)와 PMA(Sigma)를 이용하였다. IL-8 유전자의 발현은 RT-PCR과 ELISA를 이용하여 측정 하였다. NF-${\kappa}B$의존성 IL-8 유전자의 전사활성을 평가하기 위하여는 IL-8 NF-${\kappa}B$ luciferase construct를 안정적으로 유전자주입한 A549 IL-8 NF-${\kappa}B$ luciferase 세포주를 제조해 사용하였고 NF-${\kappa}B$ DNA 결합은 electromobility shift assay(EMSA)를 이용하였다. p65 전사활성을 assay하기 위해서는 Gal4-p65 fusion protein expression system을 유전자주입과 luciferase assay를 통하여 시행하였다. Transcriptional coactivator의 역할을 규명 하가 위하여서는 CBP(CREB-binding protein)와 SRC-1(steroid receptor coactivator-1) 발현 벡터를 유전자 주입하고 luciferase assay를 이용하여 확인하였다. 결과 : Luciferase assay로 triptolide가 PMA와 IL-$1{\beta}$자극에 의한 IL-8 NF-${\kappa}B$ 활성을 의미있게 감소시킴을 확인하였다. IL-8 ELISA와 RT-PCR로 triptolide가 PMA와 IL-$1{\beta}$ 자극에 의해 유도되는 IL-8 발현을 각각 단백질과 mRNA 수준에서 억제함을 관찰하였다. Triptolide가 PMA와 IL-$1{\beta}$에 의한 IL-8 NF-${\kappa}B$의 전사활성을 억제시킨 반면 EMSA와 $I{\kappa}B{\alpha}$ Western blot을 이용한 실험에서는 triptolide가 NF-${\kappa}B$ DNA 결합과 $I{\kappa}B{\alpha}$의 분해에 전혀 영향을 미치지 못함을 확인하였다. 이러한 전사활성 억제와 DNA 결합 간의 불일치의 원인으로서는 DNA 결합 이후에 발생하는 핵내 에서의 transactivation에 triptolide가 영향을 미치리라고 생각되어 p65 transactivation study를 Gal4-p65T A(p65의 transactivation domain) fusion protein 발현 시스템과 luciferase assay를 이용하여 시행한 결과 triptolide가 p65 transactivation을 억제함으로써 NF-${\kappa}B$를 억제함을 확인하였다. 그러나 CBP나 SRC-1과 같은 coactivator의 역할을 규명하기 위한 유전자주입 실험에서 triptolide에 의한 p65 transactivation 억제에 대해 CBP나 SRC-1의 과발현이 별다른 영향을 미치지 못하였다. 결론 : Triptolide는 폐상피세포에서 NF-${\kappa}B$ 의존성 IL-8 유전자의 전사활성을 억제하고 그 기전은 $I{\kappa}B{\alpha}$ 경로가 아닌 핵내에서의 p65 transactivation 억제에 의해 발생하며 이에는 CBP나 SRC-1과 같은 coactivator가 관여하지 않음을 확인하였다.