Purification and Characterization of Proteins Inhibiting Phospholipase D Activity from Flounder (Paralichthys olivaceus) Brain

넙치 (Paralichthys olivaceus) 뇌로부터 phospholipase D 활성 억제 단백질의 정제 및 특성 규명

Flounder brain cytosol contains protein inhibitors that markedly inhibit the activity of partially purified brain membrane phospholipase D (PLD) which is dependent on phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate ($PIP_2$) but insensitive to ADP-ribosylation factor (ARF), The PLD inhibitors have been enriched through several chromatographic steps and characterized with respect to size and mechanism of inhibition. Sequential chromatography of the brain cytosol yielded six inhibitor fractions, Two (IIA and IIB) of six inhibitor fractions showed the $PIP_2$-phosphatase activities. IIA was identified as synaptojanin, a nerve terminal protein that has known to be a member of the inositolpolyphosphate 5-phosphatase family, by immunoblot analysis. IIB showed an apparent molecular mass of 158 kDa by Superose 12 gel filtration chromatography and was immunologically distinct from synaptojanin. IIB hydrolyzed $PIP_2$, yielding only phosphatidylinositol phosphate (PIP) as product, suggesting that IIB hydrolyzes only one phosphate from either the 4- or 5-position of PI (4,5)$P_2$. These studies demonstrate that the existence of multiple $PIP_2$-phosphatases have been implicated in the negative regulation of $PIP_2$-dependent PLD activity within flounder brain.

본 연구에서는 넙치, Pafalichthys olivaceus 뇌 조직에서 인지질가수분해효소 D (phospholipase D, PLD) 활성의 특성 규명 및 이 활성을 억제하는 단백질을 분리 정제하여 그 특성을 규명하였다. 넙치 뇌 조직에서 PLD 활성이 관찰되었으며, 이 활성은 포스파티딜 이노시톨 비스인산염 (phosphatidyl-inositol 4,5-bisphos-phate, $PIP_2$)에 대해서 의존성을 나타내었으나, ADP-rebosylation factor (ARF)에 의해서는 영향을 받지 않았다. PLD 억제물은 넙치 뇌 조직의 세포질 분획물을 사용하여 여러 종류의 칼럼을 통하여 분리 정제하였고, 그 억제물의 분자크기 및 기작의 특성을 규명하였다. 마지막 chromatography을 통하여 여섯 개의 억제를 나타내는 분획물을 얻었으며, 이 중 두 개의 분획물인 IIA IIB는 $PIP_2$-phosphatase activities를 나타내었다. 이 중 IIA 분획물은 면역화학적 분석을 통하여 inositolpolyphosphate 5-phosphatase family로 알려져 있는 신경말단 단백질인 synaptojanin으로 동정되었다. 그리고 IIB fraction은 Superose 12 gel filtration chromatography을 통하여 158-kDa의 크기로 확인되었으며, 이것은 면역화학적 분석을 통하여 synaptojanin과는 별개의 단백질로 판명되었다. 또한, IIB 분획물은 $PIP_2$ phosphatase activity 확인 실험에서 대사산물로서 phosphatidylinositol phosphate (PIP)만을 생성하였다. 이 결과는 IIB 분획물이 $PIP_2$의 4혹은 5 위치의 인산 (phosphate) 중 어느 하나만을 선택적으로 가수분해시킨다는 것을 암시한다. 이상의 연구 결과들을 종합하여 보면, 넙치 뇌 조직에는 다양한 형태의 $PIP_2$-phosphatases가 존재하며, 이들은 $PIP_2$-의존적인 PLD 활성의 억제조절과정에서 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.