Development of In Vitro Produced Bovine Embryos after Vitrification with Various Containers

다양한 Container로 유리화 동결된 체외생산 소 수정란의 발달에 관한 연구

The objective of this study was to establish an effective cryopreservation method of in vitro-produced bovine embryos. For the vitrification, in virtro-produced embryos at 8-cell, morula and blastocyst stages were exposed to freezing solution containing 5.5 M EG (EG 5.5) for 20 sec, loaded on each containers such as EM grid, OPS and Cryo-loop, and then immediately plunged into liquid nitrogen at -196$^{\circ}C$. Thawed embryos were serially diluted in 0.5, 0.25 and 0.125 M sucrose in m-HPBS, each for 1 min, and cultured in CRlaa medium supplemented with 10% FBS. Significant differences in the rates of re-expanded and hatched embryos were not observed among these embryo containers. The total cell number of expanded blastocyst cultured in vitro after vitrification was examined by Hoechst staining. There were no differences between non-vitrified (180.0 $\pm$ 5.4) and vitrified groups (178.0 $\pm$ 7.5). In addition, when the cellular injuries after vitrification were compared by double staining. There were no significant difference in the ratio of live and dead cells between non-vitrified group (176 : 4) and vitrified group (172 : 6). Therefore, these results suggest that bovine embryos can be cryopreserved easily, effectively and successfully by vitrification using various containers, such as EM grid, OPS or Cryo-loop in the presence of EG 5.5 freezing solution.

본 연구는 체외에서 생산된 소 수정란의 동결을 위한 최적치 조건을 규명할 목적으로 실시하였다. 동결을 위하여 체외에서 생산된 8 세포기, 상실배기 및 비반포기 단계의 수정란을 공시하여 EC 5.5 동결온액에 20초 동안 노출시키고, 각 용기에 장착한 후, 즉시 -196$^{\circ}C$ 액체질소에 침지하는 유리화동결법을 채택하였다. 그 후 0.5 M, 0.25 M 및 0.121 M sucrose 용액에서 각 1분간씩, 연속으로 응해 한 다음, 10 % FBS가 첨가된 CR Iaa 배양액으로 옮겨 배양하였다. 그 결과 수정란의 재팽창률과 완전부화율은 EM grid, OPS 및 Cryo-loop 등과 같은 동결용기에 의해 큰 차이를 보이지 않았다. 또 Hoechst 염색에 의해 조사한 동결융해 후 체외에서 발달된 완전팽창 배반포의 총세포수에 있어서도, 대조군 (180.0 $\pm$ 5.4)과 동결군 (178.0 $\pm$ 7.5) 사이에 차이가 없었고, 동결융해 후 세포의 손상을 이중염색법으로 조사한 생존세포와 사멸세포의 비율도 대조군 (176 : 4)과 동결군 (172 : 6) 사이에 유의차가 인정되지 않았다. 이러한 결과로 보아 소 수정란은 EG 5.5 동결용액과 EM grid, OPS 또는 Cryo-loop과 같은 동결용기에 의해 성공적으로 동결보존할 수 있는 것으로 판단된다.