Abstract
Formation of superoxide anion $O_2\bar{{\bullet}}$ in the autoxidation of L-ascorbic acid (AsA) in the presence of heavy metal ions were determined. The generation of $O_2\bar{{\bullet}}$ was studied by using superoxide dismutase (SOD) in aqueous and buffer solution, and using nitro bule tetrazolium (NBT) in methanol solution. The remaining amount of AsA was significantly higher in the presence of SOD than in its absence. It suggested that SOD stabilizes AsA in aqueous and buffer solution because of scavenging $O_2\bar{{\bullet}}$ formed during the autoxidation reaction of AsA in the presence of heavy metal ions. NBT has an absorption maximum at about 560 nm in methanol solution. The absorbance at 560 nm increased during the oxidation of AsA, suggested the formation of $O_2\bar{{\bullet}}$in methanol solution. Thus, the formation of $O_2\bar{{\bullet}}$ was confirmed during the autoxidation of AsA not only in aqueous solution but also in methanol solution in the presence heavy metal ions.
중금속 이온 존재 하에서 AsA 자동산화반응 과정에서의$O_2\bar{{\bullet}}$ 생성을 조사하기 위해, 수용액, 완충용액, 그리고 메탄올 용액 중에서 산소가스를 통기하면서 AsA 산화반응을 유도하였다. 우선, 수용액 및 완충용액 중에 SOD를 이용하여, $O_2\bar{{\bullet}}$로부터 생성되는 $H_2O_2$를 소거하기 위해 CAT를 첨가해서, SOD 무첨가의 경우와 비교하여 실험하였다. 그 결과, 수용액 중에서도 완충용액 중에서도 SOD가 $O_2\bar{{\bullet}}$를 소거하고, SOD의 존재에 따라 AsA 산화 반응이 억제되는 것이 밝혀졌다. 또한, 완충용액 중에서는 XTT를 가지고 $O_2\bar{{\bullet}}$ 생성을 재확인하기 위해, $O_2\bar{{\bullet}}$에 의한 XTT의 환원생성물인 formazan의 생성량이 470nm에서 흡수극대를 갖는 것을 확인한 후, AsA 산화반응 과정 중에 $O_2\bar{{\bullet}}$가 생성되는 것을 확인하였다. 이처럼, Fe(III)이온 및 Cu(II)이온이 존재하는 경우에도 비존재하의 경우와 마찬가지로 AsA 자동산화반응 과정 중에서 $O_2\bar{{\bullet}}$가 생성되는 것이 확인되었다. 또한, 메탄올 용액 중에서 Fe(III)이온 및 Cu(II)이온 존재하에서의 AsA 자동산화반응 과정에서의 $O_2\bar{{\bullet}}$ 생성을 조사하기 위해 NBT법을 이용하여 흡수극대 560nm에서 NBT의 환원생성물인 bule formazan을 측정하고,$O_2\bar{{\bullet}}$ 생성을 확인하였다. 반응개시로부터 15분이 경과하면서 반응액의 색변화를 눈으로 관찰할 수 있었으며, 560nm에서의 흡광도 측정치가 높아지는 경향을 나타내어 실험적으로 $O_2\bar{{\bullet}}$가 생성되는 것을 확인하였다. 또한, AsA 산화반응을 일으키는 과정에서 산소 농도의 증가에 따라 formazan 생성량이 증가한 사실과 AsA 농도의 증가에 따라 formazan 생성량이 낮아지는 경향을 보인 사실, 그리고, AsA 농도에 따른 분해율을 조사한 결과, 본 실험에 사용된 $50\;{\mu}M$의 AsA 농도에서는 분해된 양이 거의 변화가 없는 것으로 보아 NBT가 아닌 AsA 자동산화반응 과정에서 생성된 $O_2\bar{{\bullet}}$에 의해 formazan이 생성된 것임이 확인되었다. 한편, Fe(III)이온 및 Cu(II)이온 존재 하에서 $0.01\;{\mu}M$이하의 낮은 농도에서는 $O_2\bar{{\bullet}}$ 생성이 중금속 이온 비존재 하에서의 경우보다 유의적으로 높은 것으로 밝혀졌지만, 그 이상의 농도에서는 낮은 수치를 나타내었다 이상의 결과로 보아 수용성계에서 뿐 만 아니라, 비수용성계에서도 중금속 이온 존재 하에서의 AsA 자동산화반응에서의 $O_2\bar{{\bullet}}$ 생성이 시사되었다.