사람 타액내 Testosterone의 초감도 효소면역측정법

Ultrasensitive Enzymeimmunoassay for Testosterone in Human Saliva

남성 및 여성의 타액내 testosterone의 농도를 측정하기 위하여 초감도 효소면역측정법 (ultrasensitive enzymeim-munoassay; EIA)을 정립하고, 이 EIA를 이용하여 한국인 정상 여성 및 남성의 타액에서 testosterone의 정상농도를 얻고자 하였다. 정상 월경주기를 가진 여성 18명에서 아침 6～9시 사이에 타액을 채취하였고, 남성의 타액도 오전 (9～10시)중에 채취하였다. EIA의 표지물질로는 horseradish peroxidase를 사용하였고, 기질은 ABTS [2,2'-azino-di(3-ethyl-benzthiazoline sulphonic acid)]를 사용하였다. 항원 항체 결합형과 비결합형의 분리를 용이하게 하기 위해 항혈청을 microcrystalline cellulose 에 mixed anhydrohydride 방법을 이용하여 부착시켜 사용하였다. 항원항체 결합 후 기질을 첨가하여 반응을 시키고 발색시켜 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 본 EIA의 특성을 방사면역측정법 (RIA)과 비교하여 평가하였다. 본 실험에서 정립된 EIA의 감도 (sensitivity)는 약 25 pg/tube 이하이었고, 표준시료를 첨가해 측정치와 기대치를 비교한 정확도(accuracy)는 측정치 (Y) = 0.96 X 기대치 (X) - 0.89이었고 상관계수 (r)는 0.985이었다. 본 실험에서 생산하여 사용한 항체의 역가는 1/56,000이었고, 항체의 교차반응(cross-reaction)을 다른 8종의 steroid를 이용하여 조사한 결과 5 $\alpha$-dihydrotestosterone (DHT)와 52%로 나타났으나 다른 steroids와는 0.1% 이내의 교차반응도를 나타내었다. 정밀도 (precision)는 intra-assay variation 과 inter-assay variation의 변이계수 (coeffcient of variation)가 10% 내외로 만족할 만한 범위에 들었다. 본 실험 방법을 타액과 혈청내 testosterone 농도 측정에 응용하여 RIA의 결과와 비교하여 본 바 상관관계가 타액에서 r=0.969, 혈청에서 r=0.990으로 두 결과가 잘 일치하였다. 본 실험에서 측정된 한국인 여성의 타액내 testosterone농도는 107.7$\pm$12.0 pmol／l이었고, 남성의 타액내 농도는 274.2$\pm$22.1 pmol／l이었다. 이상의 결과로 보아 본 연구에서 정립된 EIA 방법은 RIA를 대신하여 소규모의 실험실에서도 활용할 수 있을 것으로 사려된다.

A few enzymeimmunoassay (EfA) for testosterone (T) have been reported but was not suitable for all biological samples. The present study was designed to develop a rapid, ultrasensitive EIA and to apply this technique for study the physiological changes of T in biological samples. Saliva samples were collected at 06:00～09:00 hour during one menstrual cycle from 18 normally menstruating women and on 09:00～10:00 hour from 20 normal men. The present study shows an established EIA for testosterone, using horseradish peroxidase (HRP), which was covalently bonded to testosterone-3-carboxymethyloxime (T-3-CMO). One batch of T-antisera was also covalently linked to microcrystalline cellulose particles by a mixed anhydride method in order to facilitate separation of bound and free steroids. The established EIA was validated in terms of sensitivity, accuracy, specificity, precisions etc., comparing with conventional radioimmunoassay. The sensitivity of the established EIA was less than 25 pg/tube. The correlation coefficients between the expected T-values and observed T-values measured by EIA or RIA were r=0.985 and r=0.941 respectively. The cross reactivity of antiserum in EIA was a little higher than that of RIA, especially by 5 ${\alpha}$-DHT. The intra- and inter-assay precisions of the present EIA were similar to those of RIA. The present study also demonstrates that the normal T-values in saliva of Korean male ＆ female samples are 265.65${\pm}$15.80 pmol／l and 109.74${\pm}$ 12.01 pmol／l, respectively. The present EIA seems to be established and suitable for use in the endocrinological studies. The advantages of this EIA system also might make the present T-EIA an ideal procedure for use in a routine assay of ordinary laboratory with a conventional spectrophotometer.