Abstract
It is crucial to remove trophectoderm (TE) cells of blastocysts for an efficient isolation of pluripotent embryonic stem (ES)-like cells from bovine blastocysts. We evaluated the effectiveness of chemosurgery using calcium ionophore A23l87 (CIPA) by investigating the viability and pluripotency of ES-like cell lines isolated from in vitro-produced bovine blastocysts after CIPA treatment. The blastocysts treated with 50 $\mu$M CIPA for 25 min colonized most efficiently (51% of blastocysts) and developed to ES-like cell lines through 10 passages (4.8% of blastocysts) among CIPA-treated groups with different concentration and duration. In comparison with CIPA-untreated blastocysts, the colonization rate and overall viability of the CIPA-treated blastocysts were five times higher, suggesting that CIPA treatment condition defined in this study was highly efficient for establishing ES-like cell lines without apparent toxicity of CIPA. We evaluated in vitro pluripotency of the established three ES-like cell lines by examining alkaline phosphatase (AP) activity, capability of embryoid body formation, and chromosomal euploidity of the cells. Our cells showed a heterogeneous AP activity similarly to other reports. The cells were able to form simple embryoid bodies during suspension culture and majority of them showed a normal chromosome number of 60, the euploid chromosomal complement of bovine Therefore, our data suggest that CIPA treatment can be safely used for an efficient isolation of ES-like cell lines from bovine blastocysts.
소 배반포로부터 배아주 (embryonic stem, ES) 유사세포를 분리하기 위해서는 영양외배엽 (trophectoderm, TE) 세포를 제거하는 것이 효과적이다. 따라서 본 실험은 효과적으로 TE를 제거하기 위한 calcium ionophore A23187 (CIPA) 처리조건을 확립하고, 분리해낸 ES 유사세포의 in vitro 다능성 (pluripotency)을 검증하고자 수행하였다. CIPA 농도 및 처리시간을 달리 하였을 때 50 $\mu$M에서 25분간 처리한 군이 colony 형성율 (51%)및 10 passage 까지의 배양성적 (4.8%)에서 가장 좋은 결과를 나타내었다. 또한 CIPA를 처리하지 않은 군과의 비교에서도 약 5배의 높은 결과를 보임으로서 본 실험에서 확립된 CIPA 처리조건은 가시적인 toxicity 없이 ES 유사세포의 확립에 이용될 수 있음을 시사하였다. 확립된 ES 유사세포는 heterogeneous한 alkaline phosphatase (AP) 활성을 보여 소 ES 유사세포에 대한 타 보고들과 유사한 결과를 보였다. In vitro 부양배양 (suspension culture)에서는 embryoid body로 분화가 가능하였으며, 약 70% 정도의 euploidism을 보였다. 따라서 본 실험에서 확립된 CIPA의 처리조건이 소 배반포로부터 ES 유사세포를 확립하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
