Abstract
S. cerevisiae mutant(reg1-501, gal1), which cannot use galactose and has alleviated glucose repression level, is used as host for optimizing induction of GAL promoter. The optimum concentration of galactose as inducer for recombinant protein production and the galactose consumption rate have been tested with S. cerevisiae mutant and compared with conventional S. cerevisiae. The extent of glucose repression were investigated for both strain and the degradation pattern of produced foreign protein have been compared in both cases. The effect of pH on foreign protein degradation pattern were studied for both strains. The secetion efficiency of both strains were carried out. Through these experiments, optimum condition of recombinant protein production by GAL promoter using S. cerevisiae mutant (reg1-501, gal1) were found.
본 연구에서 갈락토즈를 거의 사용하지 않고 glucose repression 정도가 줄어든 변이주를 이용하여 발현최적화를 수행하였다. 두 균주에서의 GAL promoter에 의한 외래단백질 생산시 glucose repression 정도에 대해 조사하였는데 대조해 Y2805는 glucose가 다 소비된 후 2~3시간 지난 후 발현이 시작되나 변이주 Y334는 약 0.5g/L 글루코즈 농도에서 25%정도의 발현이 이루어짐에 따라 변이주 Y334는 GAL promoter에 미치는 glucose repression정도가 매우 약한 장점을 확인하였다. GAL promoter에 의한 외래 단백질 생산시 발현을 위한 최적 갈락토즈 농도를 조사하였는데, Y3805는 3% 까지의 높은 갈락토즈 농도에서, 변이주 Y334는 1%정도의 낮은 갈락토즈 농도에서 각각 최대 발현량을 보였으며 변이주 Y334는 특히 0.01%정도의 낮은 갈락토즈 농도에서도 최대 발현의 60%량을 발현하였고 오히려 높은 갈락토즈 농도에서는 성장장애 현상을 보였다. 두 균주를 이용하여 배지중 pH가 외래 단백질 생산에 미치는 영향을 조사하였는데 두 균주 모두 pH 5근처에서 최대 발현량을 보임을 알 수 있었다. GAL promoter에 의한 외래 단백질 생산시 글루코즈와 갈락토즈, 에탄올의 소비속도를 조사하였는데, 글루코즈와 에탄올의 소비속도는 거의 비슷하였으나 갈락토즈 소비속도는 Y2805는 0.1232 g/L/hr/O.D.이고, 변이주 Y334는 0.0131g/L/hr/O.D. 이다. 또한 두균주의 분비효율을 조사하였는데 Y2805는 발효후반부에 총 생산 albumin중 약 70%는 분비되었고 30%는 cell 내 위치하는 것을 알 수 있었고 Y334의 경우에는 발효후반부에 총 생산 albumin중 50%가 cell 밖으로 분비되고 50%는 cell 내에 존재하는 것으로 확인되었다. 이는 Y334의 해결해야 할 단점으로 생각 되어지며 이러한 문제의 해결을 위해 albumin 생산성이 2~3배 증가된 초분비 S. cerevisiae 돌연변이주 개발이 현재 진행중이다.