Development of Selectable Vector Plasmid in Bacteriophage P2-P4 System and Its Stability

박테리오파지 P2-P4 시스템을 위한 벡터 플라스미드 개발과 안정성

While bacteriophage P2-P4 system is very useful experimental tool for the study of viral capsid assembly, there is no useful plasmid vector for the DNA manipulation in bacteriophage P2-P4 system. In this study, a new vector plasmid, P4 ash8 (sid71) kmr, was constructed by swapping the non-essential region of P4 DNA for kanamycin resistance(kmr) gene cassette of plasmid pUC4-K. P4 ash8 sid71 was starting material for the construction, since it tends to be maintained as a plasmid in the absence of the helper phage. The total size of this chimera was designed to be packaged into P4 or P2 size heads with induction by P2 infection. The conversion of plasmid P4 ash8 (sid71) kmr to bacteriophage was proved by burst size determination experiment and CsCl buoyant equilibrium density gradient experiment. Integrase destructed P4 derivative, P4 ash8 sid71 kmr intS, was able to be constructed easily by in vitro DNA manipulation of P4 ash8 sid71 kmr. The plasmid stability experiment with P4 ash8 sid71 kmr if/tS showed that the integrase of P4 affects the stable maintenance of plasmid P4 state.

박테리오파지 P2-P4 시스템은 바이러스 조립과정 기작 연구를 위한 뛰어난 실험 소재로 연구되어 왔으나, 이 시스템에 유전자 조작상 필수적인 유용한 플라스미드가 없는 관계로 그의 필요성이 대두되고 있다. 본연구에서는 도움파지가 없을 때 플라스미드 상태로 존재하는 P4 ash8 (sid71)을 시작물질로, 항생제 내성 유전자를 도입하여 선택성을 줄 목적으로 P4 파지 증식에 불필요한 P4 DNA 단편을 pUC4-K 플라스미드의 kmr(kanamycin resistance) 유전자로 치환하여 P4 ash8(sid71) kmr을 생성하였다. 이 플라스미드는 박테리오파지 P2로 induction하여 박테리오파지 P4 상태로 증식시킬 수 있게 그 genome 크기를 조정하였으며, 파지 상태로 전환된 것을 burst size 결정 및 CsCl 부양 균등밀도 편차실험을 통해 입증하였다. 생성된 P4 플라스미드 유도체를 유전자 조작하여 P4의 integrase 기능을 잃은 변이체를 쉽게 만들 수 있었으며, 역시 박테리오파지 P4 상태로 증식시킬 수 있었다. 이러한 변이체 플라스미드의 안정성 실험을 수행하여, P4의 integrase 기능이 지속적인 플라스미드 상태 유지를 위해 필요하다는 것을 보여주었다.