생쥐 난소 과립세포의 체외배양중 세라마이드에 의한 자연세포사의 측정

Determination of Ceramide-Induced Apoptotic Cell Death in Mouse Granulosa Cell Cultured In Vitro

본 연구에서는 자연세포사 (apoptosis)를 유발시키는 것으로 알려진 ceramide를 배양중인 생쥐 과립세포에 처리한 뒤 형광염색, in-situ 3'-end labeling(ISEL), 그리고 flow cytometry 기법을 이용하여, 자연세포사 및 세포주기에 미치는 ceramide의 영향을 조사하였다. Ceramide를 처리하지 않은 대조군에 비하여, ceramide를 처리한 실험군에서 세로의 생존율은 농도에 비레하여 유의하게 감소하였다. 또한 acridine orange에 의한 형광염색 결과, 자연세포사의 양상을 보이는 핵을 갖는 세포의 수가 ceramide의 농도가 증가함에 따라 현저하게 증가되었다. 또한 ISEL을 실시해 본 결과, 자연세포사가 ceramide의 처리농도가 증가됨에 따라 점차적으로 증가되었다. 한편, ceramide를 처리한 과립세포의 세포주기 분석을 위한 flow cytometry 결과도 자연세포사가 일어난 $A_{0}$기에 있는 세포들의 비율이 대조군에 비하여 농도 의존적으로 증가하였으며, $G_{0}$/$G_{1}$ 기에 있는 세포들이 비율은 현저하게 감소됨을 관찰할 수 있었다. 위의 결과로 보아 ceramide는 생쥐 과립세포의 $G_{0}$/$G_{1}$ 기에 특이저긍로 자\ulcorner하여 자연세포사를 유발하며, 난포의 폐쇄시 과립세포의 자연세포사를 유발할 것으로 사료된다.

In mammalian ovary, major portion(>99%) of ovarian follicles undergo atresia. Recent studies have shown that this phenomenon is mediated via GC apoptosis. Ceramide, a product of sphingomyelin hydrolysis, has been proposed as a novel lipid second messenger with specific roles in mediating antiproliferative responses including apoptosis and cell cycle arrest. In the present study, we have examined the effect of ceramide on apoptotic cell death of GC in vitro. GCs were harvested by squeezing the antral follicles from the immature mice (3-4 weeks) and cultured in MEM medium with 10% fetal bovine serum. The cells were treated with various concentrations of ceramide (0 to 50 \mu M)and cultured up to 24 h.Cell death was determined by MTT cell viability assay and apoptosis was examined by acridine orange staining, in situ 3'-end labeling(TUNEL), and flow cytometry. Ceramid treatment induced apoptotic cell death of GC in a time- and a dose-dependent manner. Results of flow cytometric analysis showed that creamide-induced cell death was mostly confined to the $G_{0}$/$G_{1}$ cells. these results provide an evidence for ceramide as a lipid second messenger of apoptosis in mouse GC.