The Mechanisms of Resistance to TNF in TNF-Sensitive Cancer Cells Transfected with TNF-$\alpha$ Gene Using Retroviral Vector

암세포에서 Retroviral Vector를 이용한 종양괴사인자 유전자 이입후 획득된 종양괴사인자 내성의 기전

Background : Tumor necrosis factor(TNF) has been considered as an important candidate for cancer gene therapy based on its potent anti-tumor activity. However, since the efficiency of current techniques of gene transfer is not satisfactory, the majorities of current protocols is aiming the in vitro gene transfer to cancer cells and re-introducing genetically modified cancer cells to hoot. In previous study, it was shown that TNF-sensitive cancer cells transfected with TNF-$\alpha$ cDNA would become highly resistant to TNF. Understanding the mechanisms of TNF-resistance in TNF-$\alpha$ gene transfected cancer cells would be an important step for improving the efficacy of cancer gene therapy as well as for better understandings of tumor biology. This study was designed to evaluate the role of new protective protein synthesis in the acquired resistance to TNF of TNF-$\alpha$ gene transfected cancer cells. Method : We transfected TNF-$\alpha$ c-DNA to WEHI164, a murine fibrosarcoma cell line, using retroviral vector(pLT12SN(TNF)) and confirm the expression of TNF with PCR, ELISA, MIT assay. Then we determined the TNF resistance of TNF gene transfected cells(WEHI164-TNF) and the changes of TNF sensitivities after treatments with actinomycin D(transcription inhibitor) and cycloheximide ( translation inhibitor). Results : WEHI164 which was sensitive to TNF became resistant to TNF after being transfected with TNF-$\alpha$ gene and the resistance to TNF was partially reversed after treatment with actinomycin D, but not with cycloheximide. Conclusion : The acquired resistance to TNF after TNF-$\alpha$ gene transfection may be associated with synthesis of some protective proteins.

연구배경 : 종양괴사인자(tumor necrosis factor ; TNF)는 다양한 생물학적 기능을 가지고 있는바, 그 중 생체외에서 증명된 뚜렷한 항암효과로 말미암아 최근 항암유전자요법의 중요한 대상으로 관심을 모으고 있다. 그러나 유전자 이입의 기술적 문제로 생체외에서 암세포에 유전자 이입을 시행한 후 이를 다시 환자의 생체내로 이식하는 방법이 연구의 주종을 이루고 있다. 그러나 저지들의 과거의 연구를 포함한 여러 연구에서 TNF가 이입된 암세포는 TNF에 대해 내성을 보이는 것으로 증명되었다. 이 획득내성의 기전을 밝히는 것이 종양생물학의 이해를 넓히고 보다 효과적인 항암유전자 요법을 개발하기 위한 매우 중요한 과제로 생각된다. 저자들은 TNF 유전자 이입에 따른 암세포의 TNF에 대한 획득 내성에 새로운 방어단백질의 합성이 관여하는 지를 규명하고자 본 실험을 수행하였다. 방 법 : TNF에 감수성을 보이는 생쥐 섬유육종 세포주인 WEHI164에 TNF-$\alpha$ 유전자를 retroviral vector를 이용하여 이입하고 TNF의 발현을 시도하여 PCR, ELISA, MTT assay로 확인하였고, TNF 유전자가 이입된 세포(WEHI164-TNF)는 TNF에 내성을 보이는지 역시 MTT assay로 검증하였다. WEHI164-TNF세포를 transcription 억제제인 actinomycin D와 translation 억제제인 cycloheximide로 처리한 후 역시 MTT assay로 TNF에 대한 감수성에 변화를 보이는지 확인하였다. 결 과 : 1) TNF-$\alpha$ 유전자 이업 및 발현 확인 PCR을 시행한 결과 TNF 유전자가 이입된 WEHI164-TNF 세포주는 790 base pair 크기의 진한 DNA band를 보인 반면 모세포주는 보이지 않아서 retroviral vector를 이용한 유전자 이입이 DNA 수준에서 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 그리고 WEHI164-TNF의 배양상층액에서 TNF양을 ELISA와 MTT assay로 측정한 결과, 생물학적 활성을 지닌 TNF를 $10.9{\pm}1.47ng/24hr/10^6cells$ 생산함을 알 수 있었다. 2) TNF 유전자 이입 전후, 암세포의 TNF에 대한 감수성 비교 TNF 농도 100ng/ml 에서 모세포는 $73{\pm}5%$의 세포독성을 보인 반면 WEHI164-TNF 세포는 $3{\pm}2%$의 세포독성을 보여 통계적으로 유의하게 (p < 0.00) TNF에 대한 내성을 획득함을 알 수 있었다. 3) TNF 유전자 이입 후 획득된 TNF에 대한 내성의 기전 WEHI164-TNF 세포를 actinomycin D로 처리한 경우 TNF 농도 10ng/ml과 100ng/ml에서 각각 $24{\pm}7%$, $44{\pm}6%$의 세포독성을 보여 control의 $6{\pm}2%$, $17{\pm}2%$보다 통계적으로 유의하게(p < 0.01) TNF에 대한 감수성이 부분적으로 회복됨을 관찰할 수 있었다. 그러나 cycloheximide로 처리한 경우에서는 TNF에 대한 감수성에 변화를 관찰할 수 없었다. 결 론 : TNF에 감수성을 보이는 암세포주인 WEHI164에 TNF 유전자를 이입하여 TNF를 발현하게 하였을 때 그 세포 자신은 TNF에 대해 내성을 획득하게되며 이에는 미지의 방어단백질의 합성이 일부 관여할 것으로 판단된다.