Abstract
The in vitro regeneration and genetic transformation systems in hot pepper(Capsicum annuum L.) have not been routinely available, which has been a major limiting factor in the application of new genetic manipulations. An efficient procedure to regenerate whole pepper plants and to generate transgenic plants expressing a foreign gene was established. A relatively high frequency of plant regeneration was observed when hypocotyl and cotyledon explants were cultured on MS medium supplemented with NAA 0.1 mg/L plus zeatin 2.0 mg/L or IBA 10.0 mg/L plus BAP 1.0 mg/L. Addition of AgNO$_3$5 $\mu$M to these media improved the regeneration frequency up to 8%. For plant transformation, hypocotyl and cotyledon explants of hot pepper were precultured on shoot induction media without kanamycin added for 2 days, and then cocultured with Agrobacterium tumefaciens pDY183 for 2 days. Putative transformants were obtained from selection media containing 100 mg/L kanamycin sulfate and 500 mg/L carbenicillin. Putatively selected transformants were confirmed by amplification of selectable marker genes (ADA and NPT II) by polymerase chain reacion. Successful transcripts of ADA gene were detected by Northern blot analysis. Enzyme activity of ADA was also examined by spectrophotometric analysis, and expression of ADA gene in hot pepper suggests the potential application of ADA gene as a selectable marker in plants.
고추의 형질전환율을 높이기 위하여 우선적으로 효율적인 재분화조건을 구명하였다. 고추의 하배축과 자엽 모두 2mg/L zeatin과 0.1 mg/L NAA ( I )에서 51%, 1.0 mg/L BAP와 10.0 mg/L IBA ( II)는 45.1%의 재분화율을 보였으며, 두 배지에 5 $\mu$M AgNO$_3$을 첨가하였을 때 I의 배지에서 보다 건강한 식물체를, II의 배지에서는 재분화율이 약 8%로 증가함을 보였다. 따라서 II의 배지 조건은 가격이 비싼 zeatin의 효과를 대치할 수 있었다. 이렇게 얻어진 효율적인 재분화배지에 고추의 하배축과 자엽을 ADA와 NPT II 유전자를 함유한 Agrobacterium tumefaciens pDY183을 이용하여 형질전환을 유도하여, kanamycin 100 mg/L에서 선발하여 성공적으로 형질전환체를 얻었다. 식물체내로의 ADA와 NPT II 유전자의 도입은 PCR을 이용하여 확인하였으며, Northern blot에 의하여 ADA 유전자의 전사여부를 확인하였다. ADA 효소의 활성도는 spectrophotometer를 이용하여 측정하여 본 결과 고추세포내에서 정상적으로 발현하였으므로 동물유전자인 ADA가 식물체 형질전환시 표시 유전자로서의 사용가능성이 확인되었다.
