In Vitro Development of Vitrified Mouse Expanding/Hatching/Hatched Blastocysts

초자화 동결된 생쥐 팽창/탈출/완전탈출 배반포기배의 체내 발달

This study was carried out to investigate the in vivo development rates of vitrified-thawed mouse expanding, hatching and hatched blastoc ysts(BL). In vitro fertilization produced blastocysts were vitrified in EFS40(40% ethylene glycol, 30% Ficoll and 0.3 M sucrose in phosphate buffer saline containing 10% FBS). Expanding a and hatching blastocysts were equilibrated in 20% ethylene glyco](EG) for 5 min. before exposure to EFS40 at 25°C for 1 min., they were then vitrified in liquid nitrogen. Hatched blastocysts which cultured in m-CR1 medium supple mented 0.4% bovine serum albumin on day 5. were equilibrated in 10% EG for 5 min. and then vitrified in EFS40 for 30 sec. After thawing, re-expanding blastocysts were transferred to recipients(3 day of pseudopregnant) on one or both uterine horns(6-8 embryos per a horn). Preg¬n nancy rates of recipients and implantation were a assccessed by autopsy on 15 gestation. The res¬u ults obtained in these experiments were summar¬1 ized as follows; 1) The pregnancy and live fetus rates, for vitrified expanding BL(77.8 and 25.0%) and hatching BL(77.8 and 26.4%)n vitro were not significantly difference in those of control BL (66.7 and 42.9%: 83.3 and 40.4%), respectively, 2) in vitro development of vitrified hatched BL was 34.0%. and 3) in vivo developmental rate of vitrified hatched BL was only 33.3%. These results suggested that proposed rapid vitrification p procedures used EFS40 cryoprotectant can be effectively performed in mouse expanding Ihatching blastocysts and that mouse blastocysts a after being hatched from zona pellucida can be successfully cryopreserved.

본 연구는 초자화 동결된 생쥐 팽창, 탈출, 완전탈출 배반포기배의 체내 발달율을 조사하기 위해 실시하였다. 체외수정하여 얻어진 생쥐 배반포기배는 EFS40(40% ethylene glycol, 30% Ficoll, 0.3M sucrose)으로 초자화 동결하였다. 팽창, 탈출 배반포기배는 20% ethylene glycol에 5분동안 평형시킨 다음, EFS40 용액에 1분간 노출후 액체질소에 침지하여 초자화 동결하였다. 완전탈출 배반포기배는 0.4% BSA가 첨가된 m-CR1 배양액에서 5일동안 배양하여 얻었으며, 10% EG에 5분, EFS40에 30초동안 노출하여 초자화 동결시켰다. 융해후 재팽창이 이루어진 배반포기배는 가임신 3일된 대리모의 한쪽 또는 양쪽 자궁각에(6∼8개/자궁각) 이식하였다. 대리모의 임신율과 착상율은 임신 15일째 외과적 해부로 판정하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 임신율과 정상 산자율은 초자화 동결된 팽창 배반포기배의 경우 77.8과 25.0%이었고, 탈출 배반포기배의 경우는 77.8과 26.4%로서 각각의 대조군에 있어서 66.7과 42.9%, 83.3과 40.4%에 비해 유의차가 없었다. 2) 완전탈출 배반포기배의 체외 발달율은 34.0%였고, 3) 체내 발달율은 33.3%였다. 이러한 결과는 본 실험에 사용된 EFS40 동결액을 이용한 초자화 동결방법이 생쥐 팽창, 탈출 배반포기배의 초자화 동결은 물론, 완전탈출 배반포기의 초자화 동결에도 유용하게 이용될 수 있다는 가능성을 시사하였다.