Determination of several families of antibacterial agent residues in fish by disk assay

미생물학적 방법에 의한 어체내 잔류 항균물질의 계열별 동정시험

The possibility of identification of families of antibacterial agent residues in fish tissue was studied by disk assay using three test organisms, Bacillus subtilis BGA, Micrococcus luteus ATCC 9341, and Bacillus cereus var. mycoides ATCC 11778. In the present method, a simple clean-up procedure was performed to obtain the aqueous solution from homogenized flounder muscle sample(10g) in Mcilvaine buffer. Then, aqueous solution was fractionated into A and B to be used in disk assay by choloroform and Sep-Pak $C_{18}$ cartridge column after being defatted in hexane. The chloroform layer of fraction A was used for the analysis of macrolide antibiotics(ML), sulfa drugs(SA), chloramphenicol(CP), and quinolone antibiotics(QN). Adsorbed materials to Sep-Pak $C_{18}$ of fraction B were also employed for the analysis of penicillins(PC), tetracyclines(TC), and nitrofuran derivatives(NF) Minimun-detectable concentrations by the present method were, $0.1{\mu}g$/g for oxytetracycline, tetracycline, doxycycline, spiramycin and ciprofloxacin, $0.025{\mu}g$/g for erythromycin and ampicillin, $1.0{\mu}g$/g for sodium nifurstyrenate and florfenical, $0.25{\mu}g$/g for sulfamonomethoxie and sulfadimethoxine, $2.5{\mu}g$/g for oxolinic acid and flumequine, and $15{\mu}g$/g for piromidic acid, respectively. Three test organisms showed different sensitivity patterns for each family of antibacterial agent. Sensitivity patterns were B. cereus > B. subtilis > M. luteus for TC and NF, M. luteus > B, subtilis > B. cereus for ML and PC, B. cereus = B. subtilis > M. luteus for CP and QN, and B. subtilis > B. cereus＝M. luteus for SA. The present method utilizing these characteristics could be useful as a routine screening test for the determination of family of antibacterial agent residues in fish tissue.

어류조직내에 잔류하는 항균물질을 미생물학적 방법인 disk assay를 이용하여 항균물질의 계열별로 확인이 가능한지를 검토하였다. 본 검사법에 사용한 균주는 Bacillus subtilis BGA, Micrococcus luteus ATCC 9341, Bacillus cereus var, mycoides ATCC 11778 이었다. 본 검사법에는 보다 간편한 clean-up 전처리 조작을 실시하였다. 즉, 피검시료(10g)는 Mcilvaine 완충액으로 마쇄하여 수용액충을 추출하고, 이 수용액층을 핵산에 의해 탈지시킨 후, 클로르포름 및 Sep-Pak $C_{18}$ 카트리지를 이용하여 분획액 2종류(fraction A 및 B)를 추출하였다. 그리고 이들 분획액은 각각 disk assay에 사용하였다. 분획액 A인 클로르포름 용액층은 마크로라이드(ML)계, 설파(SA)계, 클로람페니콜(CP)계 및 퀴놀른(QN)계의 확인시험에 제공되었고, 분획액 B인 Sep-Pak $C_{18}$에 흡착된 물질은 페니실린(PC)계, 테트라사이클린(TC)계 및 니트로푸란(NF)계의 확인시험에 제공되었다. 본 검사법에 의한 항균물질의 검출 최저농도는 oxytetracycline, tetracycline, doxycycline, spiramycin 및 ciprofloxacin이 $0.1{\mu}g$/g, erythromycin과 ampicillin이 $0.025{\mu}$/g, sodium nifurstyrenate와 florfenicol이 $1.0{\mu}g$/g, sulfamonomethoxine과 sulfadimethoxine이 $0.25{\mu}g$/g, oxolinic acid와 flumequine이 $2.5{\mu}g$/g, piromidic acid는 $15{\mu}g$/g이었다. TC계 및 NF계에 대해서는 B. cereus>B. subtilis>M. luteus, ML계 및 PC계에 대해서는 M. lureus>B. subtilis>B. cereus, CP계 및 QN계에 대해서는 B.cereus=B. subtilis>M. luteus, SA계에 대하여는 B. subtilis>B. cereus=M. luteus로 항균물질의 계열에 따라 서로 다른 감수성 유형을 나타내었다. 따라서 본 미생물학적 검사법은 어류 조직내에 잔류하는 항균물질의 계열을 스크리닝하는 일상 검사법으로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.