감자의 단백질 분해효소 억제제 II 유전자의 특별한 염기서열의 자연적 제거로 인한 상처 유발성 발현의 소실

Loss of Specific Sequences in a Natural Variant of Potato Proteinase Inhibitor II Gene Results in a Loss of Wound-Inducible Gene Expression

감자의 genomic DNA library로 부터 분리한 proteinase inhibitor II (pin2) 유전자들의 제한효소 지도를 작성 하였던바 이미 분리된 상처 유발 (wound-inducible)pin2K 유전자의 것과 상이성이 있는 pin2T를 분리하여 염기서열을 결정하였다. 두 유전자의 염기서열은 전체적으로 약 86%의 동일성을 보였으며 특히 promoter 부위의 염기서열은 pin2K 유전자의 전사개시 부위의 상대적인 위치인 -714까지 네부분의 결손(20 내지 60bp)을 제외하던 약 91%수준의동일성을 보였다. 분리한 유전자들의 promoter 부위를 표지 유전자인 CAT와 GUS 유전자에 연결 시킨후 담배에서의 발현을 추적하였던바, pin2K 유전자의 promoter에 의한 표지유전자의 발현은 상처에 의해 발현 되었으나 pin2T 유전자의 promoter에 의한 표지유전자의 발현은 상처 유무와 관계없이 낮은 수준으로 나타났다. 또한 pin2T 유전자의 Promoter 내의 결손은 핵 단백질의 promoter에의 결합에 영향을 주지 않았으며 상처 유발pin2K 유전자의 promoter 염기서열과 비교하였을때 pin2T 유전자의 promoter 부위내에 5'-AGTAAA-3'라는 특별한 염기부위가 자연적으로 제거된것을 알수 있었다. 또한 5'-AGTAAh-3'의 염기부위가 다른 상처 유발 유전자들에서는 흔히 발견되고, 다른 식물 유전자들의 Promoter에서는 쉽게 발견이 되지 않았다. 따라서 상처 유발 pin2K 유전자의 Promoter내에 상처 유발과 관련있는 특별한 염기부위가 자연적으로 결실되어 pin2T 유전자의 발현이 상처 유발성을 잃은것으로 짐작된다.

We have isolated several proteinase inhibitor II genes pin2 from a Russet Burbank potato DNA library. One of these, pin2T was subcloned and a 1.8 kb Xbal/Nsil insert was sequenced. This fragment contained the complete Inhibitor II gene including 965 Up of flanking DNA upstream from the gene and 200 bp of flanking DNA downstream from the gene. The open reading frame encodes a protein that is similar to other reported proteinase Inhibitor II proteins. The DNA sequence of the 5' flanking region of pin2T from -714 to +1 is highly homologous (91% identity) with that of the previously isolated wound-inducible pin2K. There are, however, four small deletions in the pin2T promoter which are located at -221 to -200, -263 to -254, -523 to -426 and -759 to -708 relative to the transcription start site of the wound-inducible pin2K. Three of these deletions map to a portion of the promoter that controls the wound-inducibility of the proteinase inhibitor genes. Chimeric genes containing the promoter of the pin2T gene linked with the both CAT and GUS were constructed and transfered into tobacco plants. Analysis of these plants indicated that pin2T is not a wound-inducible gene but is expressed at low levels. Thus, wound-inducibility is lost with the concomitant natural deletion of three small regions of the promoter. Comparision of the sequences deleted in pin2T relative to the pin2K with Genebank sequences indicates that the deleted sequences contain a motif (consensus 5'-AGTAAA-3') that is found in many other wound-inducible genes but not easily found in the published promoter sequences of other plant genes. Nuclear proteins from unwounded and wounded potato leaves were bound to the proximal promoter region, downstream of the 5'-AGTAAA-3', of pin2T. The comparison of the pin2T gone with the pin2K gene indicates that the natural internal promoter deletions are likely responsible for loss of the wound-inducible phenotype in the pin2T gene.