Gene Expression of Enzymes Related to Glutathione Metabolism in Anticancer Drug-resistant L1210 Sublines

항암제 내성 L1210세포의 Glutathione 대사 관련효소 유전자의 발현 양상

Glutathione(GSH) has a very important role in detoxification of cells and is closely related to antitumor drug-resistance of cancer cells. In order to evaluate the importance of glutathione metabolism in the drug-resistant cancer cells, the concentration of celluar GSH and activities of ${\gamma}$-glutamylcysteine synthetase(GCS), ${\gamma}$-glutamyl transpeptidase (GGT) and glutathione S-transferases(GST) in the adriamycin, vincristine, or cisplatin resistant L1210 (L1210AdR, L1210VcR, or L1210Cis) sublines were measured. Expression and amplification of GCS, GGT, and GST-${\pi}$ genes were also observed in the parent Ll210 and the drug-resistant Ll210 sublines. The concentration of GSH was increased 5.34 fold in L1210Cis, 2.83 fold in L1210VcR, and 1.78 fold in L1210AdR, compared to L1210. The activities of GCS and GGT were increased in drug-resistant L1210 sublines. The GST activity was increased in L1210VcR and L1210Cis but decreased in L1210AdR compared to Ll210. Expression of GCS, GGT, and GST-${\pi}$ genes were increased in the resistant L1210 sublines compare to the parent L1210 in northern blot analyses. Overexpression of GCS, GGT, and GST-${\pi}$ were observed in the resistant sublines, and the increases of the concentration of glutathione and the activities of GCS and GGT in the resistant sublines may be involved in a part of the drug-resistance in the resistant sublines.

생쥐의 백혈병세포 L1210과 항암제에 대하여 내성이 유도된 L1210AdR, L1210VcR과 L1210Cis에서 glutathione의 농도와 glutathione의 합성 조절에 관여하는 ${\gamma}$-glutamylcysteine synthetase(GCS)와 ${\gamma}$-glutamyl transpeptidase (GGT), 세포 이물질을 축합하는데 촉매하는 glutathione S-transferase(GST)의 효소 활성도와 유전자의 발현 여부를 관찰하였다. 세포내 glutathione농도(${\mu}M/mg$ protein)는 L1210이 $0.41{\pm}0.003$, L1210AdR가 $0.73{\pm}0.006$, L1210VcR은 $1.16{\pm}0.060$, L1210Cis가 $2.19{\pm}0.282$으로 모세포에 비하여 내성세포에서 통계적으로 유의한 증가를 관찰하였다. Buthionine sulfoxamine(BSO)를 1 ${\mu}M$농도로 첨가하여 12시간 배양한 세포들에서의 glutathione농도는 L1210이 88%, L1210AdR가 85%, L1210VcR이 89%, 그리고 L1210Cis는 79%의 감소를 보였다. GCS의 활성도(nM/mg protein/min)는 L1210이 104인데 비하여 L1210AdR가 128, L1210VcR는 227, 및 L1210Cis는 212로 증가하였다. GGT의 활성도(nM/mg protein/min)는 L1210이 $2.15{\pm}0.531$이었고, L1210AdR은 $2.80{\pm}0.498$, L1210VcR은 $2.42{\pm}0.389$, 그리고 L1210Cis는 $2.98{\pm}0.623$으로 내성인 세포들에서 증가하였으며 L1210AdR과 L1210Cis에서 유의하였다. GST활성도(nM/mg protein/min)는 L1210이 $16.70{\pm}4.798$이었고, L1210AdR은 $14.51{\pm}3.402$, L1210VcR은 $19.52{\pm}4.255$, L1210Cis $17.77{\pm}4.495$로 L1210VcR과 L1210Cis가 약간의 증가를 보였으며, L1210AdR은 오히려 감소를 보였다. DNA의 slot blot에서 GCS, GGT, GST 유전자의 모세포와 내성세포간에 별다른 차이를 보이지 않았다. Northern hybridization에서 GCS는 약 4.5kb 크기의 band, GST-${\pi}$는 약 1.05kb 크기의 band를 보였으며 내성세포 모두에서 발현 증가가 관찰되었다. GGT의 경우 크기가 다른 6개의 band가 보였으며 특히 11.5 kb크기의 band에서 L1210AdR과 L1 210VcR의 발현이 증가하였으며, L1210VcR에서는 L1210과 다른 내성세포에서 보이는 1.95kb크기의 band가 보이지 않고 2.2kb 크기의 다른 band가 관찰되었다. 이상에서 L1210AdR과 L1210VcR의 내성에는 mdr1 유전자가 관여하고, L1210Cis의 내성에는 특히 glutathione이 중요하다. GCS, GGT 및 GST등의 활성도 및 유전자의 발현도 내성세포들에서 증가하였으며 이중 GCS는 내성세포내의 glutathione 합성에 가장 중요한 조절인자라 할 수 있다.