Agrobacterium rhizogenes를 이용한 Populus tremuloides의 형질전환

Transformation of Populus tremuloides Using Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium rhizogenes를 매개로 한 Populus의 형질전환계를 확립하고자 형질전환율에 영향을 주는 주요 인자들을 검토하고, 형질전환 식물체를 분화시켜 도입유전자의 발현을 확인하였다. 줄기조직보다 잎조직이 kanamycin에 대한 감수성이 커 형질전환체의 선발에 유리한 것으로 판단되었다. 접종용액의 박테리아 밀도는 $4{\times}10^5{\sim}7{\times}10^9\;cfu$의 범위내에서 형질전환율에 거의 영향을 주지 않았다. 공배양 기간은 1일 이내가 바람직하였고, 박테리아 제거배지의 항생제 농도는 cefotaxime과 ampicillin 각각 $250\;{\mu}g/ml$가 적당하였다. 배지에 acetosyringone을 첨가하여 배양한 박테리아를 사용했을 때 형질전환율이 증가했는데 acetosyringone의 적정농도는 $50\;{\mu}M$이었다. 형질전환된 gall은 kanamycin 농도가 $100\;{\mu}g/ml$ 이상인 배지를 사용하거나, 생장조절제가 들어있지 않은 배지를 사용하여 선택적으로 유기 및 증식시킬 수 있었다. A. rhizogenes를 접종시킨 조직으로부터 유기된 gall은 생장조절제를 포함하는 배지뿐만 아니라, 생장조절제가 없는 배지에서도 3주 이내에 뿌리를 형성하였다. NAA 0.05 mg/ml와 BA 0.5 mg/ml를 첨가한 배지에서 배양된 gall로 부터 약 6주일 후 식물체가 분화되었다. A. rhizogenes를 접종시켜 얻은 gall,그리고 gall로부터 재분화된 식물체의 추출물에서 agropine과 mannopine이 검출되어, 도입된 opine합성 유전자가 발현되고 있는 것이 확인되었다.

Several factors affecting on transformation efficiency were studied to establish a Agrobacterium rhizogenes mediated system for the transformation of Populus species, and We could obtaine tansgenic plantlets expressing the introduced gene. Leaf sections were more sensitive than stem sections to kanamycin and thought to be better material for transformant screening. The bacterial density did not affect on the efficiency of transformation over the range of $4{\times}10^5{\sim}7{\times}10^9\;cfu$. The optimum period for co-cultivation was one day or shorter. Both of the optimum concentrations of cefotaxime and ampicillin in the medium were $250\;{\mu}g/ml$ for elimination of bacteria from the inoculated leaf sections. The addition of acetosyringone in the bacterial culture medium increased transformation rate, and the highest rate was obtained at $50\;{\mu}M$ of acetosyringone. The transformed galls could be selectively induced and gown on the growth regulator-free medium or on the medium containing $100\;{\mu}g/ml$ or higher contrition of kanamycin. The roots were induced from the galls incited by A. rhizogenes within 3 weeks on the growth regulator-free medium as well as on the medium containing growth regulators. The plantlets were regenerated from the galls cultured for 6 weeks on the medium containing 0.05 mg/ml of NAA and 0.5 mg/ml of BA. The expressions of the introduced opine gene in the transformed galls and plantlets were confirmed by the analysis of agropine and mannopine.