Isolation of Cryptosporidium parvum oocysts from fecal samples - The combination of ether extraction and discontinuous sucrose gradients

분변에 함유된 Cryptosporidium parvum 오오시스트의 순수분리 -Ether extraction과 discontinuous sucrose gradients의 병용

A calf and 50 mice were infected with Cryptosporidium parvum and their fecal materials were collected and treated 10 ether extraction (EE), followed by discontinuous sucrose gradients (DSG) method. EE method was to remove some of fat or lipid from feces. Sediments were washed by centrifugation ($1,500{\;}{\times}{\;}g$ for 10 min., 3 times) In phosphate-buffered saline and then these washed sediments were sleeved sequentially through stainless steel screens with a final mesh of 250 ($61{\;}{\mu\textrm{m}}$ porosity) to remove other debris. After sieving, the materials were suspended in 2.5% potassium dlchromate solution. Oocysts were counted by using a hemocytometer and the recovery rate of pure oocysts was calculated on the basis of the count. Following centrifugation ($1,500{\;}{\times}{\;}g$ for 30 min.) by DSG method, most oocysts were recovered at the interface between a gravity of 1.103 and 1.064. The recovery rates of pure oocysts from the fecal suspension of the calf ($3.8{\;}{\times}{\;}10^7/ml$) and the mouse ($3.2{\;}{\times}{\;}10^6/ml$) treated with EE method were 81.6% and 51.6%, respectively. It is suggested that the recovery rate was dependent on the number of oocysts In each suspension treated with EE method. To get the 50% recovery rate, there must be more than $2{\;}{\times}{\;}10^6$ oocysts per ml of the fecal suspension treated with EE method. By the combination of the two methods it was possible to isolate C. parvum oocysts from normal feces of the calf and mouse as well as from dlarrhelc feces.

Cryptosporidium의 오오시스트를 분변에서 분리해 내는 방법은 많이 알려져 있으나 그러한 방법은 주로 설사변에 함유된 원충을 분리하는 데 적용되었다. 이 실험에서는 송아지와 마우스를 C. parvum으로 감염시키고, 그 분변으로부터 원충을 순수 분리하기 위해 ether extraction(EE)법과 discontinuous sucrose gradients(DSG)법을 병용하여 실시하였다. 먼저 EE법으로 분변 내의 지질이나 지방성분과 함께 큰 이물질을 제거한 후 돈망체를 사용하여 분변내의 이물질을 다시 한번 제거하였다. 동망체에 걸러진 분변 부유액을 2.5% potassium dichromate 현탄액으로 만들어 DSG법으로 원심한 결과 비중 1.103과 1.064의 sucrose gradient 경계부위에 횐 밴드가 관찰되었다. 흰 밴드 부위에서 이물질이 제거된 오오시스트를 회수할 수 있었는데 송아지와 마우스 분변을 트르롭으로 전처리한 부유액에 ml 당 오오시스트의 수가 많을수록 원충의 회수율은 높았다 송아지 분변에서 회수된 원충의 회수율은 EE법으로 처리된 부유액 내에 $3.8{\;}\times{\;}10^7/ml$개의 오오시스트가 함유되었을 때 81.6%였으며, 마우스 분변에서 회수된 원충의 회수율은 EE법으로 처리된 부유액내에 $3.2{\;} \times{\;}10^6/ml$개의 오오시스트가 함유되었을 때 51.6%이었다. 따라서 50% 정도의 원충을 회수하기 위해서는 EE법으로 전처리한 분변 부유액의 ml당 오오시스트의 수가 $2{\;}\times{\;}10^6$개 이상 되어야 할 것으로 나타났다. 또한 이 방법은 송아지의 설사분변은 물론 정상적인 분변이나 마우스 분변에 함유된, 오오시스트를 순수 분리하는데 효과적이었다.