The Effect of Superoxide Anion Production by PMN on Pneumocyte Injury in Patients with Bronchial Asthma

기관지천식환자에서 다형핵구의 과산화 음이온 생성능이 폐포세포 손상에 미치는 영향

Background : Bronchial asthma has been known as an inflmmatory disease. There have been many evidences that polymorphonuclear leukocytes (PMN) might play an important role in the pathogrnesis of asthma. Although many investigators suggested that pneumocyte injury by PMN-derived oxygen radicals may contribute to the pathogenesis of asthma, there has been few report for a direct evidence of oxygen radicals-mediated pneumocyte injury in bronchial asthma. Furthermore the exact mechanism of oxygen radicals-mediated pneumocyte injury is still controversy. This study was designed to establish a direct in vitro evidence and its clinical significance of pneumocyte injury by PMN-derived superoxide anion in bronchial asthma and to elucidate the main mechanism of superoxide anion-mediated pneumocyte injury. Methods : 12 stable asthmatics and 5 healthy volunteers were participated in this study. PMN was separated from peripheral venous blood samples by using dextran sedimentation and Ficoll-Hypaque density gradient separation method. Superoxide anion productions by PMN and plasma SOD activities were measured by spectrophotometric assay using the principle of SOD inhibitable cytochrome c reduction. PMN-mediated pneumocyte injuries were measured by $^{51}Cr$-release assay using A549 pneumocytes and were expressed as percent lysis and percent detachment. Results: 1) PMN from asthmatics produced more amount of superoxide anion compared to PMN from normal subjects ($6.65{\pm}0.58$ vs $2.81{\pm}0.95\;nmol/1{\times}10^6$ cells, p<0.05), and showed an inverse correlation with $FEV_1$(R=-0.63, p<0.05), but no correlation with $PC_{20}$ histamine in asthmatics. 2) Plasma SOD activities were decreased in asthmatics compared to normal subjects but not significant, and showed a positive correlation with $FEV_1$(R=0.63, p<0.05) but no correlation with $PC_{20}$ histamine in asthmatics. 3) There were a positive correlation between plasma SOD activity and superoxide anion production by PMN in normal subjects (R=0.88, p<0.05) but not in asthmatics. 4) PMN-mediated pneumocyte injury was predominantly expressed as cell detachment rather than cell lysis in both groups, and PMN from asthmatics showed more potent cytotoxic effect on A549 pneumocytes compated to PMN from normal subjects. PMN-mediated detachment rather than lysis of A549 pneumocytes was significantly inhibited by in vitro SOD but not by diluted serum. 5) PMN-mediated detachment rather than lysis of A549 pneumocytes showed a good correlation with superoxide anion production by PMN (R=0.90 in normal subjects, R=0.82 in asthmatics, p<0.05) but no correlation with plasma SOD activity. PMN-mediated pneumocyte injuries were not correlated with $FEV_1$ or $PC_{20}$ histamine in asthmatics. 6) There were no significant differences in PMN-mediated pneumocyte injuries between allergic and nonallergic asthmatics. Conclusion : Our results suggest that pneumocyte injury by PMN-derived superoxide anion may partially contribute to the pathogenesis of asthma and that cell detachment rather than cell lysis may be the mechanism of superoxide anion-mediated pneumocyte injury.

연구배경 : 기관지천식은 일종의 염증성 질환으로서 다형핵구가 병태생리에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 다형핵구로부터 생성되는 독성산화물들은 기도 및 폐조직 손상을 야기시켜 기관지 천식의 병인에 기여하는 것으로 알려져 있으나, 이에 대한 실질적인 증거가 아직 부족할 뿐아니라 이들이 폐조직손상을 일으키는 기전 또한 불분명하다. 이에 저자들은 기관지천식환자들의 다형핵구로부터 생성되는 과산화 음이온이 실제로 폐포세포손상에 중요한 역할을 하는지 여부와 과산화 음이온이 폐포세포 손상을 일으키는 기전을 보다 명확히 하고자 본 연구를 시작하였다. 방법 : 임상적으로 안정된 12명의 기관지천식환자와 5명의 정상인들을 대상으로 하였으며, 말초혈액 다형핵구는 말초혈액으로부터 dextran 침강법 및 Ficoll-Hypaque 밀도차 분리법을 이용하여 분리하였다. 다형핵구의 과산화 음이온 생성능 및 혈장 SOD 활성도는, 과산화 음이온이 cytochrome c를 환원시켜 나타나는 발색반응을 이용하여 분광측정법으로 측정하였으며, 다형핵구의 A549 폐포세포에 대한 세포독성작용은 $^{51}Cr$ release assay로 측정하였으며, A549 lysis 및 A549 detachment 두가지 측면에서 관찰하였다. 결과 1) 다형핵구의 과산화 음이온 생성능은 천식환자군이 정상군에 비해 현저히 높았으며 ($2.81{\pm}0.95$대 $6.65{\pm}0.58\;mmol/1{\times}10^6$ cells, p<0.05), 각 환자의 $FEV_1$과는 역상관관계를 보였으나 (R=-0.63, p<0.05), $PC_{20}$ histamine과는 상관관계가 없었다. 2) 혈장 SOD 활성도는 천식환자군이 정상군에 비해 다소 감소되어 있는 경향을 보였으나 통계학적 의미는 없었으며, 각 환자의 $FEV_1$과는 상관관계를 보였으나(R=0.63, p<0.05) $PC_{20}$ histamine과는 상관관계가 없었다. 3) 정상군에서는 혈장 SOD 활성도와 다형핵구의 과산화음이온 생성능간에 의미있는 상관관계를 보였으나(R=0.88, p<0.05), 천식환자군에서는 상관관계가 없었다. 4) 두군 모두에서 다형핵구에 의한 A549 폐포세포의 손상형태가 lysis 보다는 detachment가 더욱 현저한 경향을 보였으며, 두가지 모두 천식 환자군에서 다소 높은 경향을 보였다. 또한 두군 모두에서 SOD 전처치에 의해 A549 detachment는 현저하게 억제되었으나 A549 lysis는 억제되지 않았으며, 두가지 모두가 혈창 전처치에 의해서는 억제되지 않았다. 5) 두군 모두에서 다형핵구의 과산화 음이온 생성능과 A549 detachement와는 유의한 상관관계가 있었으나(정상군 : R=0.90, 환자군 : R=0.82), A549 lysis와는 별로 상관관계가 없었으며, 혈장 SOD 활성도는 상관관계를 보이지 않았다. 또한 천식환자군에서 A549 lysis나 A549 detachment는 환자의 $FEV_1$ 도는 $PC_{20}$ histamine과는 의미있는 상관관계를 보이지 않았다.6) 다형핵구에 의한 폐포세포손상의 양상에 있어서 알레르기성 천식환자와 비알레르기성 천식환자 사이에는 의미있는 차이가 없었다. 결론 : 이상의 연구결과 다형핵구로부터 생성되는 과산화 음이온에 의한 기도 및 폐조직 손상이 기관지천식의 병인에 부분적으로 영향을 미칠 것으로 생각되며, 과산화 음이온은 주로 폐포세포의 탈락을 야기시킴으로써 폐포세포 손상을 일으키는 것으로 추측된다.