Comparison of Various DNA Extraction Methods for Diagnosis of Tuberculosis Using a Polymerase Chain Reaction

중합효소연쇄반응을 이용한 결핵의 진단에 있어서 각종 DNA 추출방법의 비교

Background: The polymerase chain reaction (PCR) is a very sensitive method for the detecting of mycobacterial DNA. There are many reports revealing the efficacy of PCR for the diagnosis of M. tuberculosis, but there are many different methods for DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis. Bead beater method is a very useful method for DNA extraction from clinical spectimens, but its procedures are relatively complicated and time-consuming. So we studied other methods for the DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis $H_{37}Rv$ and some clinical specimens (5 smear positive sputa and 5 smear negative CSF). Method: We extracted the mycobacterial DNA with 6 different methods from H37Rv strain and clinical specimens. The methods included SDS-microwave oven method, NaOH lysis method, Triton X-100-Proteinase K method, Lysis buffer method, SDS-proteinase K method and bead beater method. The target DNA was 123bp of IS6110 and was detected by examination of ethidium bromide-stained agarose gels. Results: Among 6 methods, SDS-proteinase K method, bead beater method, lysis buffer method and triton X-100-proteinase K method were excellent, but SDS-proteinase K method was the best method in the aspect of simplicity and cost-effectiveness. Conclusion: We suggest that SDS-porteinase K method is a simple and convinient method and might be the best method for the extraction of mycobacterial DNA.

연구배경 : 결핵은 아직도 한국에서는 중요한 질병의 하나이지만 결핵을 진단하기 위한 보편적인 방법들이 단점인 예민도와 검사기간등이 문제가 되고 있다. 최근 분자유전학에 PCR 기법이 도입된 이래 결핵균의 DNA를 추출하여 짧은 시간내에 결핵을 진단하고자 하는 많은 보고들이 있어 왔다. 그러나 보고된 방법들의 다양성과 각 방법에 따른 소요시간등이 매우 다른 것이 문제가 되고 있고 임상에서 빠른 시간내에 비교적 간단한 방법으로 결핵율의 DNA를 분리한다면 보다 빨리 결핵을 진단하여 치료를 할 수 있다고 생각되어 결핵균의 DNA를 분리하는 방법중 가장 좋은 방법을 확인하고자 하였다. 방법 : 결핵율의 DNA를 추출하는 방법은 총 6가지의 방법으로서 SDS-microwave oven method, NaOH lysis method, Triton X-100-proteinase K method, Lysis buffer method, SDS-proteinase K method 및 Bead beater method를 사용하여 비교하였으며 사용된 균주는 Mycobacterium tuberculosis $H_{37}Rv$ strain 이었고 임상가검물중 도말양성 객담 5예 및 결핵성 뇌막염이 의심되고 도말음성이었으나 항결핵제 투여로 완치판정을 받은 환자의 뇌척수액 5예를 대상으로 하였다. 사용된 primer는 IS6110의 123bp를 target DNA를 하였고 PCR반응은 각각 $94^{\circ}C,\;68^{\circ}C$ 및 $72^{\circ}C$ 로 각각 2분씩 총 30주기를 시행하였다. 결과 : $H_{37}Rv$ strain에서 각 방법으로 추출된 DNA를 10배씩 serial dilution하여 PCR을 시행한 결과 SDS-microwave oven법과 NaOH lysis법은 50 fg까지 양성이었으며 나머지 4가지 방법에서는 5fg까지 양성이었다. 또한 각각의 방법으로 도말양성 환자의 객담에서 PCR을 시행한 결과 전예에서 양성이었고 결핵성 뇌막염이 의심스러운 환자의 뇌척수액에서는 SDS-microwave법과 NaOH lysis법으로는 5예중 3예에서 양성이었고 나머지 4가지 방법으로는 5예중 4예에서 양성이었다. 결론 : 이상의 실험으로 경제적이고 간편한 측면에서 볼 때 SDS-proteinase K법이 가장 좋은 방법임을 알 수 있었다.