Cloning and Expression of an Insecticidal Crystal Protein CryIIA Gene from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 CryIIA의 내독소 단백질 유전자의 클로닝 및 발현

The CryIIA gene encoding the insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiens!s subsp. kurstalri HD-l has been cloned in Escherichia col!, and its nucleotide sequences were determined completely. 5kb Hindlli fragment harboring CryIIA gene was screened in the large ca. 225kb plasmid DNA by southern blot. HindlIT digested 5kb fragment was ligated into pUC19 and transformed in E. coli. The 4kb BamHI-HindlIT fragment containing the CryIIA gene was subcloned and named pSKIIA. DNA sequence analysis demonstrates that pSKIIA is the gene of an operon which is comprised of Lhree open reading frames (designated orn, orf2 and or£3). The CrylIA gene is composed of 3,952bp-long BamHI-Hindill DNA restriction fragment. The orf3 code for a polypeptide of 633 amino acid residues. The protoxin protein has a predicted molecular weight of 70,780. The E. coli derived protoxin gene product is biologICally active against three species of Lepidopteran (Plu.lelia maculipennis, He/iolhis assulta, Spodoptera litura) and a species of Dip Leran( Culex pipines) larvae in bioassay.

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1으로부터 생산된 살충성 내독소 단백질을 coding하는 CryIIA 유전자를 클로닝하고 염기서열을 조사하였다. HD-1 균주의 12개 plasmid 중 225kb plasmid를 분리하여 CryIIA 유전자를 포함하는 5kb HindIII 절편을 hybridization하여 찾아냈다. 이 절편을 plasmid pUC19에 ligation하여 E. coli에 형질 전환하였다. 이 독소 유전자를 포함하는 4kb BamHI-HindIII 절편은 vector pT7-5에 ligation하여 pSKIIA라하였다. pSKIIA는 3개의 open reading frames(orf1, orf2, orf3)로 구성되어 있으며 염기서열은 3,952base로 되어 있었다. 이러한 3개의 orf 각각의 발현 여부를 확인하기 위하여 생물검정을 하였다. 그러나 orf1 또는 orf2에 의한 형질 전환체는 독성이 없는 것으로 나타났다. orf3를 포함하는 형질 전환체는 3종의 나비목 곤충(배추점나방, 담배거세미나방, 담배나방) 및 1종의 파리목 곤충(집모기) 유충에 대하여 독성을 나타내었다.