대장균에서의 Tn5 단백질 증폭생합성 및 안정성

Amplified synthesis and stability of Tn5 polypeptides in escherichia coli

Transposon Tn5의 단백질 합성을 E. coli 내에서 증폭 합성시키기 위하여 Bacteriophage의 Pt 촉진유전자가 Tn5의 두 개 module인 IS50L 과 IS50R을 전사시킬 수 있도록 plasmid를 재구성하였다. P1 촉진유전자로부터의 전사를 탈억제시켰을 경우, IS50R으로부터 합성되는 두 개의 단백질은 모두 그 세포내 축적량이 SDS-polyacrylamid gel에서 확인 될 정도로 증폭합성되었으나 IS501L의 두 개 단백질들은 동일 gel 상에서 확인되지 않았다. Minicell system에서 합성양상과 각 단백질들의 안정성을 조사한 결과, IS50R 단백질은 모두 안정하게 유지되었으나 IS501, 단백질은 모두 불안정하여 생분해 되어 진다는 사실을 밝혔다. 이러한 Is50L 단백질의 불안정성은 IS50L이 transposition에 있어서 불활성을 나타내는 원인이라 추정된다. 또한 IS50L고 IS50R의 단백질은 모두 동일한 open reading frame에 의하여 합성되어짐을 tryptic peptide 양상을 통하여 알 수 있었다.

Plasmid DNA molecules containing strong promoter upstream from IS50L or IS50R, the two insertion sequences that flank Tn5, were constructed to amplify the synthesis of Tn5-encoded polypeptides. When proteins made by cells that contain these plasmids were analyzed on polyacrylamide gels, enhanced synthesis of IS50R polypeptides could be detected. Synthesis of this polypeptide apparently is initiated within the large open reading frame of this element. In addition, the stability of IS50L-and IS50R-encoded polypeptides was analyzed. It was found that IS50L polypeptides are relatively unstable in vivo. This instability could account for the observed inability of this element to promote transposition.