Isolation and Fusion of Pea Mesophyll Protoplast

완두(Pisum sativum L.) 엽육세포(葉肉細胞) 원형질체(原形質體)의 분리(分離) 및 융합(融合)

This experiment was conducted to identify the enzyme treatment time, calcium ion effect, enzyme concentration and leaf position for protoplast isolation. It was also performed to determine the adequate molarity on protoplasts, and to investigate the incubation time, pH, PEG concentration and DMSO effect for protoplast fusion. The results obtained were summarized as follows ; The optimal time of incubation in enzyme solution was 4 hours. And the protoplast releasing time was delayed by $CaCl_2{\cdot}2H_2O$ addition to the enzyme solution compared with no added one. The viability had kept up to above 95% until the 4 hours after digestion. The high viability of the protoplast was preserved more than 16 hours by adding $CaCl_2{\cdot}2H_2O$ to digestion solution. The enzyme concentration had no effect on protoplast yield in range from 1% to 5% and the first or second leaf from the top of the plant produced the highest protoplast yield among the leaf position tested. The purity of healthy protoplast was better in 0.4M and 0.5M sucrose than in others, and the percentage of protoplast aggregation was more 20% to 50% in PEG 6,000 compared with 4,000 and PEG 1,500. Even though the percentage of protoplast aggregation was less increased by 3% to 7% than without DMSO, its treatment was effective to induce binucleated protoplasts.

완두엽육세포(葉肉細胞)의 원형질체분리(原形質體分離) 및 융합(融合)에 있어서 효소(酵素)의 처리시간(處理時間), $CaCl_2{\cdot}2H_2O$의 효과(效果), 효소(酵素)의 농도(濃度)와 엽(葉)의 위치(位置)에 따른 원형질체(原形質體)의 분리(分離)에 미치는 영향(影響)과 Mole 농도(濃度)에 따른 원심분리효과(遠心分離效果), PEG용액(溶液)의 처리시간(處理時間), 산도(酸度)에 따른 융합효과(融合效果) 그리고 dimethyl sulfoxide 첨가효과(添加效果)를 구명(究明)하기 위하여 실시(實施)한 실험(實驗)의 결과(結果)는 다음과 같다. 1. 원형질체(原形質體)의 분리(分離)에는 4시간(時間)의 산소처리(酸素處理)가 가장 양호(良好)했고 $CaCl_2{\cdot}2H_2O$의 첨가(添加)에 따라 원형질체(原形質體)의 분리속도(分離速度)가 늦어졌으며 활성도(活性度)는 4시간(時間)까지 변동(變動)이 없었고 $CaCl_2{\cdot}2H_2O$ 의해서 활성도(活性度)가 장기간(長期間) 유지(維持)되었다. 2. 산소(酸素)의 농도(濃度)는 1% 이상의 처리(處理)에서 거의 동일(同一)한 원형질체분리율(原形質體分離率)을 나타냈으며 상위(上位) 1~2엽(葉)이 가장 좋은 원형질체분리율(原形質體分離率)을 보였으며 원심분리효과(遠心分離效果)는 0.4M, 0.5M에서 양호(良好)하였다. 3. 원형질체융합(原形質體融合)은 PEG 6000용액(溶液) 75분(分) 처리(處理)에서 좋은 융합율(融合率)을 보였다. 그러나 30분(分) 이내(以內)의 처리(處理)가 활성도(活性度)에 영향(影響)을 미치지 않았으며 pH 5.8인 PEG 6000의 0.2M용액(溶液)에서 가장 높은 62.84%의 융합율(融合率)을 나타내었다. dimethyl sulfoxide에 의한 효과(效果)는 융합율(融合率)이 3~7% 감소(減少)하지만 binucleate의 유도(誘道)에 유효(有效)한 것으로 추정(推定)된다.