Isolation and Culture of Protoplasts from Embryonic Cotyledons of Pinus densiflora S. et Z.

소나무 자엽(子葉)을 이용(利用)한 원형질체(原形質體) 나출(裸出) 및 배양(培養)

Protoplasts were isolated from cotyledons of germinating Pinus densiflora S. et Z. seeds. The seeds were germinated for nine days, and excised embryonic cotyledons about 3-4mm long were incubated with Cellulase Onozuka R-10 and Macerozyme. After 8 hours of incubation, large number of viable protoplasts were isolated. Isolated protoplasts were cultured in a medium containing basal salts of $B_5$ medium, vitamines, amino acids, organic acid, sugars, and growth hormones. The first evidence of protoplast budding was observed after twelve hours in culture, and it suggested that high potential of the embryonic cotyledons for rapid cell division affected the early budding, rather than effect of culture medium was shown in twelve hours. The three- to four-cell stage was reached after three to four days of culture. Most cell divisions were achieved by additional buddings rather than equal binary cell division. No further cell division was observed beyond the four-cell stage. Protoplasts isolated from fully expanded cotyledons (germinated for 17 to 24 days) seldom initiated or failed to initiate cell division.

침엽수류(針葉樹類)의 원형질체(原形質體) 배양(培養)의 가능성(可能性)을 시험(試驗)하기 위하여 소나무 종자(種子)의 자엽(子葉)에서 원형질체(原形質體)를 나출(裸出)하여 배양(培養)을 시도(試圖)하였다. 9일(日)동안 발아(發芽)시킨 채종원산(採種園産) 소나무 종자(種子)에서 길이가 3~4mm 가량 되는 자엽(子葉)을 잘라내서 Cellulase Onozuka R-10과 Macerozyme을 첨가(添加)한 효소용액(酵素溶液)에서 8시간(時間) 처리(處理)하여, 활성(活性)이 높은 원형질체(原形質體)를 대상(大量)으로 얻었다. 나출(裸出)된 원형질체(原形質體)를 $B_5$ 배양(培養)의 무기염(無機鹽), 비타민, 아미노산, 유기산(有機酸), 당류(糖類), 식물(植物)홀몬이 들어있는 배지(培地)에 배양(培養)하였을 때, 12시간(時間) 경과(經過) 후(後) 첫 budding이 관찰(觀察)되었으며, 3~4일(日) 후(後) 3~4개(個)의 세포(細胞)로 분열(分裂)하였다. 세포분열(細胞分裂)은 적도판(赤道板)을 가운데 둔 이등분식(二等分式) 분열(分裂)이 아니고, 대부분(大部分) 효모균(酵母菌)과 같이 budding에 의한 분열(分裂)이었다. 세포분열(細胞分裂)은 4개(個)의 세포상태(細胞狀態)에서 중단(中斷)되어 더 이상 진전(進展)되지 않았다. 소나무 종자(種子)를 17일(日) 혹은 24일간(日間) 발아(發芽)시켜서 완전(完全)히 자란 자엽(子葉)을 사용(使用)했을 때에는 원형질체(原形質體) 나출(裸出)은 쉽게 이루어졌으나, 배양시(培養時)에 세포분열(細胞分裂)이 이루어지지 않았다.