• 제목, 요약, 키워드: Ultra-rapid PCR

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Human Immunodeficiency Virus (HIV) 검출물 위한 초고속 이단계 PCR 진단법 (Ultra-Rapid Two-Step Real-Time PCR for the Detection of Human Immunodeficiency Virus (HIV))

  • 이동우;김을환;유미선;김일욱;윤병수
    • 미생물학회지
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    • v.43 no.4
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    • pp.264-272
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    • 2007
  • 인간면역결핍바이러스(Human Immunodeficiency Virus; HIV) 진단을 위한 초고속 실시간 PCR법을 개발하였다. 검출 대상의 DNA 염기서열은 495염기 HIV-1 특이 env 유전자(gi_l184090)및 294염기 HIV-2 특이 env 유전자(gi_1332355)를 사용하였다. 초고속 실시간 PCR은 microchip에 $6\;{\mu}l$의 PCR 용액을 탑재하는 $Genspector^{TM}$ (Samsung, Korea)을 사용하였으며, PCR의 각 회전 중 단지 두 단계(denaturation, annealing/extension)를 극단적으로 짧은 시간을 주어 수행하게 하였다. 융점분석을 포함한 30회전의 PCR 검색 시간은 총7분30초 이내에 완료되었으며, HIV-1 특이 117염기와 HIV-2 특이 119염기의 PCR산물은 최소 $2.3{\times}10^3$개의 각 env 유전자로부터 30회전의 2단계 초고속 PCR에 의해 성공적으로 증폭시킬 수 있었다. 이러한 초고속 실시간 PCR법은 HIV의 빠른검색뿐 아니라, 다른 병원채의 빠른 검색에도 유용하계 적용될 수 있을 것이다.

Ultra Rapid Real-Time PCR에 의한 Human Immunodeficiency Virus (HIV)의 신속진단법 (Ultra-Rapid Real-Time PCR for the Detection of Human Immunodeficiency Virus (HIV))

  • 이동우;김을환;유미선;한상훈;윤병수
    • 미생물학회지
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    • v.43 no.2
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    • pp.91-99
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    • 2007
  • 인간면역결핍바이러스(Human immunodeficiency virus; HIV) 진단을 위한 다중, 초고속실시간 PCR법을 개발하였다. 검출대상의 DNA 염기서열은 env 유전자를 기반으로 설계되었으며, 각기 HIV-1 특이 495염기(gi_1184090) 및 HIV-2 특이 294염기(gi_1332355)의 DNA를 안정상의 이유로 PCR을 이용한 유전자합성법으로 제작하여 사용하였다. 초고속 실시간 PCR은, PCR의 회전 중 각 단계별 설정시간을 극단적으로 축소하여, $1\;{\mu}l$의 PCR 용액용 microchip을 탑재할 수 있는 $Genspector^{TM}$을 사용하여 수행하였다. DNA 증폭과 융점분석을 포함한 총 PCR 검색 시간은 HIV_1 및 HIV-2 모두에서 15분 이내로 완료되었으며, 각기 최소 2.3개의 합성 env 유전자로부터도 HIV-1 특이 117염기와 HIV-2 특이 119염기의 PCR산물을 성공적으로 증폭시킬 수 있는 민감성을 보여주었다. 이런 형식의 실시간 PCR법을 본 연구에서 초고속실시간 PCR (Ultra-rapid real-time PCR)이라 명명하였다. 이는 본 연구의 대상인 HIV에 대한 보조적 진단방법일 뿐 아니라 PCR 검색법이 사용되고 있는 다른 병원체에 대하여도 적용될 수 있을 것이나, 우선 HIV 임상시료에 대한 본 검색법의 효용성 실험 등 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

꿀벌 6종 주요 병원체에 대한 초고속 다중 PCR 검출법의 개발 (Development of Ultra-Rapid Multiplex PCR Detection against 6 Major Pathogens in Honeybee)

  • 임수진;김정민;이칠우;윤병수
    • 한국양봉학회지
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    • v.32 no.1
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    • pp.27-39
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    • 2017
  • 꿀벌 6종 주요 감염성 질병을 동시 진단하기 위한 PCR-chip 기반 초고속 다중 PCR 진단법을 개발 하였다. 6종 주요 꿀벌 감염성 병원체들은, 세균성 질병인 미국부저병의 원인균, Paenibacillus larvae와 유럽부저병의 원인균인 Melissococcus plutonius, 또한 진균인 Ascosphaera apis(백묵병), Aspergillus flavus(석고병)와 Nosema apis, Nosema ceranae(노제마병)를 선발하였다. 개발된 PCR-chip 기반 초고속 다중 PCR은, 꿀벌 주요 병원체 6종에 대하여 각기 $10^3$ 분자이상이 존재할 경우 모두 성공적 증폭을 보였으며, 증폭여부의 확인에 걸린 시간(Ct-time)은 6종 중 4종은 9분 내외, 2종은 7분 내외이었으며, 총 40회전의 PCR은 11분 42초, 융점분석 1분 15초로 총 PCR분석에 소요된 시간은 12분 57초(40회전 및 융점분석)이었다. 표준 DNA 기질을 사용한 PCR-chip 기반 초고속 다중 PCR은 100%에 근접한 정확도를 보였으며, 꿀벌 genomic DNA를 사용한 실험에서 false-amplification은 발견되지 아니하였다. PCR-chip 기반 초고속 다중 PCR은 실험실 내 초고속 진단 뿐 아니라 양봉 현장에서도 신속하고 효율적인 병원체 검출법이 될 것으로 기대한다.

조류인플루엔자 H5N1 바이러스 유전자의 신속 검출을 위한 초고속 다중 실시간 PCR법의 개발 (Development of Ultra-rapid Multiplex Real-time PCR for the Detection of Genes from Avian Influenza Virus subtype H5N1)

  • 김을환;이동우;한상훈;임윤규;윤병수
    • 대한수의학회지
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    • v.47 no.4
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    • pp.399-407
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    • 2007
  • Cause of high lethality and dissemination to human being, new development of rapid method for the detection of highly pathogenic Avian Influenza Virus (AIV) is still necessary. For the detection of AIV subtype H5N1, typical pathogenic AIV, new method to confirm sub-typing of this virus is also needed. For the purpose of ultra-rapid detection and sub-typing of hemagglutinin and neuraminidase of AIV, this study was planned. As the results we could demonstrate an ultra-rapid multiplex real-time PCR (URMRT PCR) for the detection of AIV In this study, the URMRT PCR were optimized with synthesized AIV H5- and AIV Nl-specific DNA templates and GenSpector TMC, which is a semiconductor process technology based real-time PCR system with high frequencies of temperature monitoring. Under eight minutes, the amplifications of two AIV subtype-specific PCR products were successfully and independently detected by 30 cycled ultra-rapid PCR, including melting point analysis, from $1{\times}10^3$ copies of mixed template DNA. The URMRT PCR for the detection of AIV H5N 1 developed in this study could be expected to apply not only detections of different AIVs, but also various pathogens. It was also discussed that this kind of the fastest PCR based detection method could be improved by advance of related technology in near future.

초고속 이단계 PCR에 의한 Shiga 독소 타입 1의 신속 검출법 (Rapid Detection for Shiga Toxin Type 1 (Stxl) by Using Two-Step Ultra-Rapid Real-Time (URRT) PCR)

  • 김일욱;강민희;권순환;조성학;윤병수
    • 미생물학회지
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    • v.44 no.3
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    • pp.203-211
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    • 2008
  • Shiga 독소 생성 대장균(Shiga toxin-producing Escherichia coli; STEC)을 가장 빠르게 검출할 수 있는 초고속 이단계 PCR 방법을 개발하였다. 검색 대상 유전자는 STEC에서 생성되는 Shiga 독소(Shiga toxin; Stx)를 암호화하고 있는 유전자 stx1이며, 1쌍의 stx 유전자 특이 primer를 사용하여 검출을 수행하였다. 초고속 PCR (Ultra-rapid PCR)은 microchip 기반의 6 ${\mu}l$ PCR 용량의 Real-time PCR을 사용하고, PCR 회전의 각 단계 중 혼성과 중합을 한 단계로 하였을 뿐 아니라, 각 단계의 적용시간을 각 1초, 3초(해리, 혼성/중합)가 되게 극단적으로 줄여, 검사소요시간을 최소화하였다. 35회전의 PCR 진단에 사용된 시간은 6분38초였으며, 용융온도분석에서 stx1 특이 유전자가 검출되었음을 확인하는 데까지 총 7분 28초가 소요되었다. 또한 민감도 측정에서 $3{\times}10^0$ CFU/reaction까지 성공적으로 검출 가능함이 확인되었고, 용융온도분석에서 이 증폭산물은 일정한 $81.42{\pm}0.34^{\circ}C$의 용융온도를 갖는 것으로 확인되었다. 이 검사법을 다양한 STEC 균주들에게 적용하여 그 성능을 검증하였으며, 이로써 본 초고속 이단계 PCR 방법은 Shiga 독소 생성 대장균의 초신속 검출에 바로 적용될 수 있을 것으로 기대한다.

초고속 유전자 증폭법을 이용한 서양뒤영벌 의심병원체 Lysinibacillus fusiformis의 신속 검출법 (Rapid Detection for Lysinibacillus fusiformis, a Suspicious Pathogen of Bombus terrestris, using Ultra-Rapid PCR)

  • 김소민;임수진;김정민;김병희;;윤병수
    • 한국양봉학회지
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    • v.32 no.3
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    • pp.181-189
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    • 2017
  • 2008년 서양뒤영벌의 급작스런 폐사로 인하여 뒤영벌에 대한 병원체로 그 가능성이 제기된 Lysinibacillus fusiformis는 현재까지도 뒤영벌 병원체로써 의심되고 있다. 본 연구에서는 가장 빠르고 간편한 L. fusiformis 검출방법을 고안한 것으로, L. fusiformis 특이 초고속 PCR를 개발하여, 뒤영벌 성충으로부터 L. fusiformis 검출에 소요되는 시간을 최소화한 것이다. 최적화된 L. fusiformis 특이 유전자 초고속 PCR을 적용하였을 때, L. fusiformis의 감염여부는$1.0{\times}10^8$ 분자 수를 기준으로 4분 22초만에 판정할 수 있었으며, 최소 $1.0{\times}10^1$ 분자의 재조합 DNA까지 정량적으로 측정할 수 있었다. 또한, L. fusiformis 특이 유전자 초고속 PCR을 이용하여 국내에서 상업적으로 생산된 뒤영벌을 검사하였으며, 4개 지역에서 각 1개체씩 실험한 결과, L. fusiformis가 검출됨에 따라, 국내 최초로 뒤영벌에서 L. fusiformis의 존재를 확인할 수 있었다. L. fusiformis 특이 유전자 초고속 PCR법은 실험실 내에서 뿐만 아니라 현장에서 정량적 검출을 하기에 유용한 방법이 될 것이며 더 나아가 뒤영벌 수출입을 위한 검역 기준으로 사용되기를 기대한다.

Slow Bee Paralysis Virus (SBPV) 신속 검출을 위한 초고속 역전사 중합효소 연쇄반응법의 개발 (Development of Ultra-Rapid Reverse-Transcription PCR for the Rapid Detection against Slow Bee Paralysis Virus (SBPV))

  • 김소민;임수진;김정민;임윤규;윤병수
    • 한국양봉학회지
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    • v.32 no.3
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    • pp.171-180
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    • 2017
  • Slow Bee Paralysis Virus (SBPV)는 꿀벌 그리고 뒤영벌의 병원성 바이러스로써, 벌의 앞발을 마비시킴으로 폐사를 야기한다. 본 연구는, 뒤영벌에서 빠르게 SBPV 검출하고자 SBPV 특이 초고속 PCR법을 개발한 것을 보고하는 것이다. SBPV 특이 초고속 PCR은 제반 조건을 최적화한 후, $1.0{\times}10^8$ 분자의 SBPV 특이 유전자의 존재를 3분 35초 만에 인식할 수 있었으며, 최소 $1.0{\times}10^1$ 분자의 DNA까지 정량적으로 측정할 수 있었다. 한편, 국내외에서 생산된 뒤영벌을 시료로 SBPV 특이 초고속 역전사 PCR을 시행하였으며, 수입된 뒤영벌과 국내생산 뒤영벌 1종에서 SBPV가 존재함을 보일 수 있었다. 국내 처음으로 뒤영벌에서의 SBPV의 존재를 확인한 것이다. SBPV 특이 유전자 초고속 역전사 PCR법은 실험실 내에서 뿐만 아니라 현장에서 정량적 검출을 하기에 유용한 방법이 될 것이며 더 나아가 뒤영벌 수출입을 위한 검역 기준을 이용하여 집단적 발병 방지에 기여하기를 기대한다.

초고속 Real-time PCR을 이용한 Tomato yellow leaf curl virus의 신속진단 (Ultra-rapid Real-time PCR for the Detection of Tomato yellow leaf curl virus)

  • 김택수;최승국;고민정;이민호;최형석;이세원;박경석;박진우
    • 식물병연구
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    • v.18 no.4
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    • pp.298-303
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    • 2012
  • 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus; TYLCV)는 온실가루이(Bemisia tabaci)에 의해서 영속전염되는 DNA 바이러스로 토마토에 발생하는 가장 중요한 병 중 하나이다. 우리나라에서 TYLCV는 2008년 최초로 보고된 이래 급속하게 전국적으로 확산되어 토마토 생산에 심각한 경제적 손실을 일으키고 있다. 토마토 생산과정에서 TYLCV의 확산을 최소화하기 위해 바이러스의 조기진단이 매우 중요하다. 본 연구에서는 바이러스의 신속진단을 위해 초고속 정밀 PCR 진단기술을 개발하였으며, 이는 마이크로칩을 기반으로 하여 $5{\mu}l$의 시료만으로 PCR을 수행할 수 있도록 고안된, 휴대가 가능할 정도의 소형 GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR 기기를 이용한 새로운 기술이다. 본 연구에서 개발된 초고속 정량 PCR을 이용하였을 때 TYLCV 진단을 위한 30 cycle의 PCR과 용융점분석(melting curve analysis)에 15분 이내의 시간이 소요되었으며, GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR을 이용한 초고속 정밀진단 기술은 향후 TYLCV의 대발생을 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각한다. 본 연구결과는 GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR기반의 초고속정량 PCR 기술을 이용한 식물 바이러스의 진단기술 개발로는 최초의 보고이다.

초고속 유전자 증폭법을 이용한 벌집꼬마밑빠진벌레 (Aethina tumida)의 신속한 검출 기법 개발 (Development of Rapid Detection System for Small Hive Beetle (Aethina tumida) by using Ultra-Rapid PCR)

  • 김정민;임수진;;홍기정;윤병수
    • 한국양봉학회지
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    • v.32 no.2
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    • pp.119-131
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    • 2017
  • 벌집꼬마밑빠진벌레 (Small hive beetle; SHB; Aethina tumida)의 신속검출과 대량 조사를 위하여 SHB 특이 초고속 유전자 증폭법을 개발하였다. 3쌍의 Aethina tumida-특이 유전자 증폭용 프라이머들은 벌집꼬마밑빠진벌레의 미토콘드리아 유전체 중 cytochrome oxidase subunit I (COI) 유전자에 근거하여 선발하였다. 최적화된 초고속 PCR은 $2.1{\times}10^1$ 분자의 작은벌집딱정벌레 COI 유전자를 18분 40초만에 특이적으로 그리고 정량적으로 검출할 수 있었다. 양봉현장의 적용을 위하여, 봉변으로부터 쉽게 DNA를 추출하는 방법을 고안하였으며, 봉변 1g 중 $10^5$ 분자의 벌집꼬마밑빠진벌레 COI 유전자가 존재할 경우(1/1000의 SHB 유충 사체), 10분 이내에 벌집꼬마밑빠진벌레의 존재와 분자적 정량을 마칠 수 있었다. 제안하는 이 실험법이 양봉현장에 널리 적용되어, 벌통 내 벌집꼬마밑빠진벌레의 침입여부 판단, 증식의 수준, 그리고 침입지역의 파악 및 제어에 활용되기를 기대한다.

Acute Bee Paralysis Virus (ABPV)의 정확한 검출을 위한 Nested 초고속 PCR법 개발 (Development of Nested Ultra-Rapid PCR Method for the Accurate Detection of Acute Bee Paralysis Virus (ABPV))

  • 김문정;김정민;김병희;김소민;;윤병수
    • 한국양봉학회지
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    • v.33 no.3
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    • pp.165-180
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    • 2018
  • Acute bee paralysis virus (ABPV) is an infectious disease causing paralysis in healthy honeybee colonies. Because ABPV is highly homologous with relative viruses, it is difficult to distinguish ABPV from especially IAPV or KBV by molecular diagnosis. In this study, for accurate and specific detection of ABPV, a secondary nested PCR detection method following the primary detection PCR against ABPV was developed. It could be able to detect from less than 100 molecules of ABPV. The detection time was also minimized from RNA extraction to PCR. Using ultra-rapid ABPV-specific detection and nested PCR, the presence of ABPV was detected from infected bee samples within 50 minutes. It might be expected that this kind of detection would be helpful for accurate detection and monitoring of ABPV in environment.