DOI QR코드

DOI QR Code

Anti-oxidant and Anti-microbial Activities of Herb-combined Remedies used in Traditional Korean Medicine for Treating Breast Cancer

유암 처방에 사용되어온 한약재 복합 처방전의 항산화 및 항균활성에 관한 연구

  • Choi, Eun-Ok (Anti-Aging Research Center, Dongeui University) ;
  • Son, Da Hee (Department of Biochemistry, Dongeui University College of Korean Medicine) ;
  • Kim, Min Young (Anti-Aging Research Center, Dongeui University) ;
  • Hwang-Bo, Hyun (Anti-Aging Research Center, Dongeui University) ;
  • Kim, Hong Jae (Anti-Aging Research Center, Dongeui University) ;
  • Jeong, Jin-Woo (Anti-Aging Research Center, Dongeui University) ;
  • Hong, Su Hyun (Department of Biochemistry, Dongeui University College of Korean Medicine) ;
  • Park, Cheol (Department of Molecular Biology, College of Natural Sciences and Human Ecology, Dongeui University) ;
  • Choi, Yung Hyun (Anti-Aging Research Center, Dongeui University)
  • 최은옥 (동의대학교 항노화연구소 및 블루바이오소재개발센터) ;
  • 손다희 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) ;
  • 김민영 (동의대학교 항노화연구소 및 블루바이오소재개발센터) ;
  • 황보현 (동의대학교 항노화연구소 및 블루바이오소재개발센터) ;
  • 김홍재 (동의대학교 항노화연구소 및 블루바이오소재개발센터) ;
  • 정진우 (동의대학교 항노화연구소 및 블루바이오소재개발센터) ;
  • 홍수현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) ;
  • 박철 (동의대학교 자연.생활과학대학 분자생물학과) ;
  • 최영현 (동의대학교 항노화연구소 및 블루바이오소재개발센터)
  • Received : 2016.04.18
  • Accepted : 2016.06.22
  • Published : 2016.06.30

Abstract

Sipyukmiryuki-eum (SYMYKE), Danjacheongpi-tang (DJCPT), Jipae-san Ⅰ (JPS Ⅰ), Jipae-san Ⅱ (JPS Ⅱ), and Chungganhaeul-tang (CGHUT) are representative herb-combined remedies used in traditional Korean medicine for treating breast cancer patients, as mentioned in "Dongeuibogam." In this study, we investigated the total phenolic contents (TPCs) and the anti-oxidant and anti-microbial activities of hot water and 70% ethanol extracts of these herbal prescriptions. Among the five herb-combined remedies, the extraction yields of the hot water extracts and 70% ethanol extracts were the highest in JPS Ⅱ (34.30%) and DJCPT (30.50%), respectively. The TPCs of the hot water extracts from the herb medicines were rich in the order of JPS Ⅰ < CGHUT < JPS Ⅱ < SYMYKE < DJCPT. In addition, the 70% ethanol extracts from the herb medicines were rich in the order of JPS Ⅱ < JPS Ⅰ < CGHUT < SYMYKE < DJCPT. Among them, DJCPT and SYMYKE displayed a strong anti-oxidant capability, which was determined using ferric-reducing anti-oxidant power and scavenging of 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl and 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) cationic radical activity assays. In addition, anti-microbial activities against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were stronger in the 70% ethanol extracts than in the hot water extracts. Together, these findings reveal a positive relationship between TPCs and their anti-oxidant activities.

Keywords

Antimicrobial activity;antioxidant activity;total phenolic contents;traditional herb-combined remedies

서 론

활성산소종(reactive oxygen species: ROS)은 생체 내에서 에너지를 생산하는 산화과정 에 생성되는 물질로, 생체 내 존재하는 항산화방어계로 인해 대부분 소멸된다[26, 35]. 하지만 과도하게 발생된 ROS는 산화적 스트레스를 유발하여 유전자 돌연변이 유발과, 체내 세포와 조직에 비가역적인 손상 및 각종 암의 발생뿐 만 아니라 치매와 같은 퇴행성 신경 질환의 주요한 원인이 되고[3, 16, 22], 면역 질환[19, 38], 당뇨병[31] 및 노화[17] 등과 같은 다양한 병리적인 상황을 초래하게 된다.

최근 전세계적으로 널리 사용되어 왔던 전통 약재를 기반으로 새로운 항산화 후보물질을 탐색하여 생체방어, 노화억제, 암을 비롯한 여러 질병 예방 및 치료에 이용하려는 생리활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 우리나라에서 전통적으로 사용되어 왔던 한약재는 합성 약품에 대한 부작용 우려, 한약재 가공 기술의 발달 등으로 수요가 꾸준히 증가되고 있으며, 통증완화[8], 해독[32], 해열[1], 방부[6], 항염증[40] 등과 같은 효능이 있어 질병치료와 예방의 목적으로 빈번하게 활용되고 있다. 아울러 그 동안 동의보감(東醫寶鑑, Dong-eui-bo-gam)에 기록된 다양한 처방들의 항산화능에 대한 연구가 이루어져 왔으나, 그들의 활용도 측면에 근거한 항산화 효능의 비교는 여전히 미약한 실정이다.

특히 전통적으로 유암(乳癌) 치료에 사용되어 온 대표적인 처방들 중 지패산과 청간해울탕의 항염증과 항암효과에 대한 보고는 있었지만[15, 24, 37], 각각의 처방을 비교한 결과는 없었고, 지패산의 항산화·항균활성[2, 29]과 십육미류기음의 항산화·항균 활성[23] 외에는 항산화와 항균활성에 대한 연구가 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 동의보감에 기록된 유암 치료를 위하여 사용되어 온 5가지 처방[십육미류기음(十六味流氣飮, Sipyukmiyuki-eum, SYMYKE), 단자청피탕(單煮靑皮湯, Danjacheongpi-tang, DJCPT), 지패산 Ⅰ(芷貝散Ⅰ, Jipae-san Ⅰ, JPS Ⅰ), 지패산 Ⅱ(芷貝散Ⅱ, Jipae-san Ⅱ, JPS Ⅱ), 청간해울탕(淸肝解鬱湯, Chungganhaeul-tang, CGHUT)]을 선정하여[14] 열수 및 에탄올로 추출하여 이들의 항산화 효과 및 항균 효과에 대한 생리활성 정도를 비교 조사하였다. 이러한 연구를 수행하고자 하는 목적은 오랫동안 전통의학에서 사용되어온 한약복합처방전의 항산화 및 항균 생리활성을 재평가하고 다양한 질환으로의 적응 가능성을 탐색함이다. 이를 위하여 이들 5가지의 처방에 대한 총 페놀 함량(total phenolic contents, TPC), ferric reducing antioxidant power (FRAP) 활성능, 2,2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonate) cationic (ABTS·+) radical 소거능 및 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 산화 손상에 의한 genomic DNA (gDNA)의 손상 억제능 등과 같은 다양한 항산화 효능 실험을 통하여 이들의 항산화능을 평가하였으며, Staphylococcus aureus (포도상구균)와 Escherichia coli (대장균)에 대한 항균효과를 비교하였다.

 

재료 및 방법

시료 및 추출수율

5가지의 처방에 사용된 한약재는 ㈜서경한방약업사(Busan, Korea)에서 각 처방구성의 파쇄된 형태로 구입하였으며 이들의 구성 한약재는 Table 1에 나타내었다. 열수 추출물을 얻기 위하여 약재 무게의 10배에 해당하는 증류수로 100℃에서 3시간 동안 추출하였다. 이후 열수 추출액을 여과지(Whatman No. 3 filter paper, Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 거른 후 동결건조기를 사용하여 분말로 만들어 멸균 증류수에 100 mg/ml의 농도로 녹이고, Minisart® Syringe filter (0.2 μm, Sartorius AG, Weender Landstr. Germany)로 거른 후 사용 전까지는 -20℃에서 보관하였다. 70% 에탄올 추출물은 각각의 한약재 60 g에 2 l의 70% 에탄올을 가하여 초음파추출(ultrasonification extraction)로 추출물을 제조하였다. 이를 위해 추출 용기에 한약재와 70% 에탄올을 혼합한 후 초음파 수조(Power Sonic 405, SJ BioLab., Anyang, Korea) 바닥에 닿지 않도록 하여 40 KHz 초음파를 가하여 2시간 동안 추출하였다. 각각의 추출물은 여과지로 여과한 후 용매를 Rotary evaporator (Eyela, A-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하고, 각 농축물은 동결 건조하여 분말화시켰다. 이를 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma- Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 100 mg/ml로 stock solution을 만들어 실험에 따라 적절하게 희석하여 사용하였다. 각 추출물들의 수율(Table 2)은 추출액을 동결건조 시켜서 건물 중량을 구한 다음 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.

Table 1.The composition of five traditional herb-combined remedies used in this study

Table 2.1)Sipyukmiyuki-eum; 2)Danjacheongpi-tang; 3)Jipae-san Ⅰ; 4)Jipaesan Ⅱ; 5)Chungganhaeul-tang.

총 페놀 함량

각 처방 추출물들에 함유된 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법[39]에 준하여 측정하였으며, gallic acid (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 표준물질로 사용하였다. 이를 위하여 적정 실험 농도로 희석한 시료 50 μl에 2%의 Na2CO3 1 ml를 첨가하고 2분간 실온에 방치한 후 50% Folin-Ciocalteu reagent(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 50 μl를 가하고 실온에서 30분간 반응시킨 다음 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 이용하여 검량선을 작성하였으며, 총 페놀 함량은 mg gallic acid equivalents (GAE)/g of sample dry weight (DW)으로 나타내었다.

FRAP 활성 측정

이 방법은 산성 pH 영역에서 ferric tripyridyltrizaine (Fe3+-TPTZ) 복합체가 환원성 물질에 의해 청색의 ferrous tripyridytriazine (Fe2+-TPTZ)으로 환원되어 593 nm에서 흡광도가 증가 하는 원리[4]를 이용한 것으로 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점에 착안하여 고안된 실험방법이다. FRAP에 의한 한약재 추출물들의 항산화력을 측정하기 위하여 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 및 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1:1 (v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다. 이어서 한약재 추출물 적정 농도로 희석된 시료액 10 μl와 240 μl의 FRAP 시약을 혼합하고 37℃에서 5분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군(positive control)은 trolox(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 검량선을 작성하였으며, 결과는 mg trolox/g of sample dry weight (DW)로 나타내었다.

DPPH radical 소거능

DPPH radical에 전자를 공여함으로써 radical을 소거하는 효과를 측정하는 방법인 DPPH radical 소거능은 Guo 등[13]의 방법에 준하여 조사하였다. 이를 위하여 0.4 mM의 DPPH(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액 150 μl에 처방 추출물이 적정 농도로 희석된 시료 100 μl을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader로 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 반응물에 대한 흡광도 값을 대조군에 대한 처방 추출물 시료의 DPPH radical 소거 활성으로 항산화 활성도를 나타내었으며, trolox를 양성대조군으로 비교하였으며, 음성 대조군으로는 0.4 mM DPPH 용액 대신 메탄올을 이용한 아래식에 준하여 산출하였다.

DPPH radical scavenging activity (%) = 100-[(OD of sample/ OD of control) ×100]

ABTS radical cation 소거능

Potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리 radical이 제거되어 radical 특유의 색인 청록색으로 탈색되는 것을 이용한 ABTS radical cation 소거능을 이용한 처방 추출물들의 항산화능 측정은 Re 등[30]의 방법에 준하여 조사하였 다. 즉 7 mM의 ABTS (Sigma-Aldrich Chemical Co.)와 2.45 mM potassium persulfate를 1:1로 혼합하여 실온, 암하에서 24시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 734 nm에서 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 희석하였다. ABTS radical cation solution 190 μl에 실험 농도로 희석한 시료 10 μl를 가하여 실온에서 6분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며 trolox를 양성 대조군으로 하여 다음 식에 준하여 항산화 효능을 비교하였다.

ABTS radical scavenging activity (%) = 100-[(OD of sample/ OD of control) ×100]

gDNA 분리

gDNA 분리는 AquaPure Genomic DNA isolation Kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 C6 신경교종 세포로부터 추출하였다. 이를 위하여 C6 세포를 100 mm dish에 1×105 cells/ml로 세포를 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양 후 세포를 모으고, gDNA lysis 용매를 이용하여 세포를 용해한 후 protein precipitation 용매 100 μl를 첨가하였다. 그 후 반응액을 20초 동안 빠르게 vortex 한 후 15,000× g에서 3분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 새로운 튜브에 모으고 100% isopropanol 300 μl을 첨가하였다. 혼합물은 1분 동안 15,000× g에서 원심분리하고 상층액을 제거한 후 건조시켰다. 완전히 건조 후 70% ethanol 300 μl를 첨가하여 DNA pellet을 세척하고, 다시 15,000× g에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 15분 동안 튜브를 완전히 건조시켰다. DNA pellet은 DNA hydration 용액에 용해시키고 5분~1시간 동안 65℃에서 반응시킨 후, DNA 순도를 spectrophotometer (DU730, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용한 260/280 nm에서 측정하였다. 그 후 분리된 DNA는 1.5% agarose gel 전기영동으로 분리하였다.

Radical에 의한 DNA 손상 측정

H2O2에 의한 DNA 산화는 Milne 등[28]의 방법에 준하였으며, DNA 산화적 손상의 유발 및 후보 추출물의 보호 효과를 조사하기 위하여 적정 농도 후보 추출물의 존재 또는 없는 조건에서 FeSO4와 H2O2의 최종 농도가 각각 200 μM과 2 mM이 되게 하여 같은 양을 첨가하였다. 그 후 gDNA 반응액은 물과 10 mM의 ethylenediaminetetra acetic acid (EDAT, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 4 μl를 혼합하여 최종부피가 40 μl가 되게 각 반응액의 부피를 설정하였다. 각 반응액의 부피 설정 후 gDNA, 추출물 시료, FeSO4, H2O2와 물을 혼합하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 그 후 산화 반응을 정지시키기 위하여 10 mM EDAT 4 μl를 첨가하고, 1.5% agarose gel에 100 V로 전기영동하였다. 30분 후 gel을 ethidium bromide(EtBr, Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 염색하고 AlphaEase® gel image analysis software (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)을 이용하여 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상의 회복 정도를 관찰하였다.

항균활성

항균활성을 평가하기 위해 사용된 S. aureus와 E. coli는 한국생명공학연구원(Korea Research Institute Bioscience and Biotechnology, Daejeon, Korea) 생물자원센터 유전자은행에서 구입하였으며, Table 3에 제시한 조건에서 배양하였다. 한약재 추출물들의 항균활성은 paper disc agar diffusion법을 이용하였으며[10], 사용한 공시균의 활성화 배지 및 검색용 평판배지는 luria-bertani (LB) agar를 사용하였다. 시험용 균액은 공시균들을 각 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 이상 배양하고 2회 이상 계대 배양하여 활성화시킨 후 각 공시균들을 평판배지에 100 μl씩 도말 접종한 다음, 직경 8 mm의 멸균된 paper disk (Advantec, 6 mm, Tokyo, Japan)를 평판 배지의 표면에 놓고 밀착시켰다. 시료 희석액을 100 μl씩 점적하고 37℃에서 24-48시간 배양하여 disk 주위의 clear zone 형성 유무를 관찰하여 항균 활성을 비교하였다.

Table 3.The microorganisms and culture condition

통계처리

각각의 평가 분석은 3반복 이상으로 하였으며 시료로부터 얻어진 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan′s multiple range tests를 실시하였다. 이때 사용한 모든 통계분석은 SPSS 17.0 (IBM SPSS Inc, New York, USA) 통계 프로그램을 이용하여 처리하였다.

 

결과 및 고찰

추출수율 및 페놀 함량 비교

본 연구에서 선정한 5가지의 처방 추출물의 생리활성을 비교하기 위하여 얻은 각 처방 추출물의 수율은 Table 2에 나타낸 바와 같다. 이는 각 추출물들의 추출액을 동결건조 시켜서 건물 중량을 구한 다음 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타낸 값이다. 추출수율은 물을 용매로 사용하였을 때 지패산 Ⅱ가 34.30%로 다른 시료에 비하여 월등히 높았으며, 에탄올을 용매로 사용하였을 때는 단자청피탕이 30.50%로 높게 나타났으며, 지패산 Ⅱ 에탄올 추출물이 16.9%로 가장 낮았다. 본 연구의 결과와 직접 비교할 수 있는 선행자료는 미비하지만, Bae 등[2]의 결과에서 청피 메탄올 추출물의 수율이 11.4%인 것과 비교했을 때 에탄올 추출물의 수율이 높게 나온 것을 확인할 수 있었다. 단자청피탕의 에탄올과 열수 추출물의 수율에 차이가 나는 것과, 지패산 Ⅱ의 열수와 에탄올 추출물의 수율에 차이가 나는 것은 같은 시료라 하더라도 추출용매와 시료와의 비, 추출용매의 종류, 추출온도 및 시간 등 여러 조건에 따라 달라질 수 있기 때문으로 생각된다.

다음은 준비된 추출물을 대상으로 총 페놀 함량(TPC)을 비교하였는데, 페놀 복합물(phenolic compounds)은 phenolic hydroxyl기를 가지는 방향족 화합물의 총칭으로 식물의 주요 2차 대사산물에 해당되며[12, 41], 한약재에 존재하는 vitamin A, C, E, flavonoid 및 carotenoid 등과 함께 대표적인 항산화 물질이다[11, 34]. 5종의 처방 추출물로부터 페놀 복합물을 용출하기 위하여 추출용매를 달리하여 gallic acid를 표준용액으로 선정하여 작성한 검정곡선으로부터 각 추출물의 페놀 물질 함량을 비교하여 Table 4에 나타내었다. Table 4에 나타낸 바와 같이, 5가지의 처방 추출물의 총 페놀 함량은 30.16±0.29~306.95±0.60 mg GAE/g DW의 범위로 나타났으며, 추출용매에 따라 페놀 함량에 차이를 나타냈다. 아울러 열수 추출물의 페놀 함량은 단자청피탕 > 십육미류기음 > 지패산 Ⅱ > 청간해울탕 > 지패산 Ⅰ과 같은 순서에 따라 함량이 높게 나타났으며, 에탄올 추출물의 경우도 단자청피탕과 십육미류기음에서 높게 나타났으며, 지패산 Ⅰ 및 지패산 Ⅱ에서 상대적으로 낮게 용출되었다. 일반적으로 식물성분의 페놀 복합물은 극성용매에서 용해도가 높아 유기용매에서 총 페놀량의 추출 수율이 높은 것으로 알려져 있는 것처럼[5, 9, 33], 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 페놀 함량이 높게 측정되었다.

Table 4.Values are presented as the mean ± SD. 1)Hot water extracts of Sipyukmiyuki-eum; 2)Hot water extracts of Danjacheongpi-tang; 3)Hot water extracts of Jipae-san Ⅰ; 4)Hot water extracts of Jipae-san Ⅱ; 5)Hot water extracts of Chungganhaeul-tang; 6)70% ethanol extracts of Sipyukmiyuki-eum; 7)70% ethanol extracts of Danjacheongpi-tang; 8)70% ethanol extracts of Jipae-san Ⅰ; 9)70% ethanol extracts of Jipae-san Ⅱ; 10)70% ethanol extracts of Chungganhaeul-tang

항산화 활성 비교

다음은 5가지 처방 추출물의 항산화능을 비교하기 위하여 먼저 FRAP법을 적용 하였다. FRAP법은 대상 시료의 환원력을 전자공여를 통한 radical의 소거능과 관련이 높은 것으로 알려져 있으므로, 산화반응의 촉매제로 작용하는 금속이온을 환원시키는 효력을 측정하는 방법이다[4]. Table 5의 결과에서 알 수 있듯이, 추출물 중 가장 높은 환원력을 보인 처방은 단자청피탕 에탄올 추출물(140.84±3.11 mg Trolox/g)이었으며, 지패산 Ⅱ 에탄올 추출물에서 가장 낮은 값(20.82±0.20 mg Trolox/g)을 나타내었다. 아울러 FRAP법에 의한 항산화 효능을 전체적으로 비교해보았을 때, 총 페놀 함량이 높을수록 뛰어난 효력을 보였음을 알 수 있었다.

Table 5.Values are presented as the mean ± SD.

이상의 결과를 바탕으로 5가지의 처방 추출물의 항산화능을 DPPH 및 ABTS radical 소거능을 이용하여 다시 조사하였다. 먼저, DPPH radical에 대한 소거 활성은 free radical을 환원시키는 능력이 클수록 높은 항산화 활성 및 ROS 소거활성을 기대할 수 있는 방법이다[21]. Fig. 1에 나타낸 바와 같이, 5가지 처방 추출물 중 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 가장 높은 농도에서 단자청피탕이 44.8%, 십육미류기음이 33.45%로 나타났으며, 열수 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 가장 높은 농도에서 단자청피탕이 22.65%로 가장 활성이 높았고, 그 다음으로 십육미류기음이 21.72%로 나타나, 단자청피탕이 처방에 비하여 뛰어난 DPPH radical 소거능이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 1.Effects of hot water (A) and 70% ethanol extracts (B) of SYMRKE, DJCPT, JPS Ⅰ, JPS Ⅱ and CGHUT on DPPH radical scavenging activity. The absorbance of only DPPH solution at 517 nm was 0.98±0.032 (experimental control). Trolox was used as the positive control. Each point represents the mean ± SD of three independent experiments.

한편 ABTS radical cation decolorization은 친수성 및 친유성 물질의 항산화 활성을 측정하기 위해 사용되는 방법이기 때문에 더 민감하게 항산화 능력을 알아 볼 수 있고, 양이온 radical을 소거하기 때문에 자유 radical을 소거하는 DPPH assay와 차이를 가지며 DPPH radical 소거능과 함께 항산화 활성을 검출하는데 많이 이용되고 있다[25]. 즉 ABTS free radical이 추출물 속의 항산화 물질에 의해 제거되는 것을 측정하여 항산화 효과를 확인할 수 있는 방법이며, 5가지 처방 추출물의 ABTS free radical에 대한 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 2에 제시하였다. 처방 추출물 중 에탄올 추출물의 ABTS radical 소거 활성은 가장 높은 농도에서 단자청피탕이 70.8%, 십육미류기음이 61.7%로 나타났고, 열수 추출물의 ABTS radical 소거 활성은 가장 높은 농도에서 십육미류기음이 14.4%로 가장 활성이 높았고, 그 다음으로 단자청피탕이 14.0%로 나타나, DPPH radical 소거 활성능의 결과와 유사하였음을 알 수 있었다. 아울러 각 추출물의 항산화력은 이들 시료에 함유되어 있는 총 페놀 함량이 증가할수록 우수하게 나타나, 페놀 함량과 높은 연관성이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 2.Effects of hot water (A) and 70% ethanol extracts (B) of SYMRKE, DJCPT, JPS Ⅰ, JPS Ⅱ and CGHUT on ABTS radical scavenging activity. The absorbance of only ABTS solution at 734 nm was 0.71±0.032(experimental control). Trolox was used as the positive control. Each point represents the mean ± SD of three independent experiments.

잘 알려진 바와 같이 산화적 스트레스는 직접적인 DNA 손상을 유발하므로[20, 36], DNA의 산화적 손상에 대한 5가지 처방의 방어 능력을 확인하기 위하여 C6 세포에서 분리된 gDNA를 대상으로 조사하였다. Fig. 3에 나타낸 바와 같이, 5가지 처방의 열수 및 에탄올 추출물 모두 저농도에서부터 산화적 스트레스에 의해 손상된 DNA를 보호하는 효과를 나타내었다. 이는 추출용매와 추출방법에 따라 항산화능에 차이를 보였던 것과는 달리 열수와 에탄올 추출물 모두에서 gDNA를 산화적 손상으로부터 효과적으로 보호하였음을 확인할 수 있었다. 이러한 효과는 시료에 포함되어있는 항산화제의 역할을 하는 화합물들이 ROS에 의한 세포 손상을 보호하는 세포간의 방어 기전에 의한 영향이라는 앞선 다른 연구들과 유사한 결과임을 보였다[18, 27].

Fig. 3.Protective effects of hot water (A) and 70% ethanol extracts (B) of five traditional herb-combined remedies on genomic DNA oxidation in C6 glial cells. Genomic DNA purified from C6 glial cells was pre-treated with the indicated extracts for 1 hr and exposed to OH· using fenton reaction. Untreated genomic DNA served as a control.

항균활성 비교

5가지 처방 추출물의 항균활성을 조사하기 위해 포도상구균(S. aureus)과 대장균(E. coli)을 이용하였다. 이들 균주들을 agar 배지에 배양하고 paper disc에 추출물을 첨가한 후, 미생물의 생육저해로 나타나는 clear zone의 크기를 측정하는 disc diffusion assay [10]를 이용하여 항균 활성을 비교한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 결과에서 알 수 있듯이 각 균주마다 추출물의 종류에 따라 감수성에 다소 차이가 있었으며 처방 간에 차이뿐만 아니라 추출용매와 추출방법에 따라서도 다소 감수성에 차이가 나타났음을 알 수 있었다.

Fig. 4.Antimicrobial activities of hot water (A) and 70% ethanol extracts (B) of five traditional herb-combined remedies on microorganisms. The indicated extracts of herb-combined remedies were loaded on the agar plates spreaded with S. aureus and E. coli, and then the bacteria were incubated for 24 hr under aerobic condition (1, control (DW); 2, positive control (chloramphenicol, 0.1 mg/ml); 3, 50 mg/ml of each extract; 4, 100 mg/ml of each extract).

먼저 그람양성균에 속하는 S. aureus에서는 열수 추출물 중에서 십육미류기음이 우수한 항균력을 보여주었고, 에탄올 추출물 중에서는 단자청피탕을 제외하고 S. aureus에 대하여 모두 항균활성을 가지는 것으로 나타났다. 본 연구 결과와 유일하게 비교할 수 있는 Bae 등[2]의 연구에서 청피의 ethyl acetate 분획물이 S. aureus에 대해 큰 항균력을 나타낸 반면, 열수 추출물과 메탄올 추출물에서는 효과가 나오지 않았다는 점에서 본 연구의 결과와 유사하였음을 확인할 수 있었다. 또한 청피의 chloroform extract는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에서 높은 항균 활성이 있었다고 보고되었는데[2], 본 연구에 사용한 단자청피탕의 열수와 에탄올 추출물에서는 항균 효과를 관찰할 수 없었다(data not shown). 한편 그람 음성균인 E. coli에서는 단자청피탕, 지패산 Ⅰ과 십육미류기음 에탄올 추출물에서 상대적으로 높은 항균효과가 나타났다(Fig. 4). 이러한 시료들 간의 항균활성의 차이는 추출물에 함유된 물질간의 상호작용과 균에 대한 특이적 항균 활성에 의한 것으로 생각되며, 또한 항균성 물질의 추출온도, 용매농도 및 용매의 종류에 따라 감수성에 차이가 나타나는 것으로 생각된다. 결과적으로 항산화 활성이 높은 편이었던 십육미류기음이 그람 양성 및 음성균주에서 고르게 항균 활성을 보여, 총 페놀 함량과 항산화 및 항균 활성과 연관성이 있다는 선행 연구의 결과[7]와 잘 일치함을 알 수 있었다.

본 연구에서는 한의학에서 전통적으로 유암의 치료에 사용되어 온 5가지 처방 추출물의 항산화 및 항균 활성을 조사하였으며, 처방 추출물 중 단자청피탕에서 가장 많은 페놀 복합물이 용출되었고 가장 우수한 항산화능을 보여주었다. 두 번째로 많은 페놀함유량을 나타낸 십육미류기음도 마찬가지로 비교적 높은 항산화 활성과 항균활성을 나타내었다. 따라서 이러한 생리활성이 각 추출물에 함유되어 있는 페놀성 화합물과의 높은 상관관계가 있음을 확인하였으며, 이러한 결과들은 향후 수행할 항암, 항염증, 항산화 활성 및 관련 분자생물학적 기전 연구를 위한 기초 자료로서 활용할 것이다. 아울러 각 추출물에 함유되어 있는 지표물질의 발굴과 함께 각 처방들의 표준화를 위한 기초자료로 활용할 수 있는 근거자료로 이용될 수 있을 것이다.

References

  1. Benzie, I. F. and Strain, J. J. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay. Anal. Biochem. 239, 70-76. https://doi.org/10.1006/abio.1996.0292
  2. Akkol, E. K., Das, S., Sarker, S. D. and Nahar, L. 2012. The treatment of inflammation, pain, and fever using medicinal plants. Adv. Pharmacol. Sci. 2012, 476985.
  3. Bae, J. H., Park, H. K. and Bae, H. J. 2005. Antimicrobial effect of Citrus unshiu Markovich extracts on food-borne pathogens. Kor. J. Food Cookery Sci. 21, 40-46.
  4. Barrera, G., Gentile, F., Pizzimenti, S., Canuto, R. A., Daga, M., Arcaro, A., Cetrangolo, G. P., Lepore, A., Ferretti, C., Dianzani, C. and Muzio, G. 2016. Mitochondrial dysfunction in cancer and neurodegenerative diseases: Spotlight on fatty acid oxidation and lipoperoxidation products. Antioxidants (Basel) 5, pii: E7. https://doi.org/10.3390/antiox5010007
  5. Borisover, M., Reddy, M. and Graber, E. R. 2001. Solvation effect on organic compound interactions in soil organic matter. Environ. Sci. Technol. 35, 2518-2524. https://doi.org/10.1021/es001810d
  6. Choi, I. J., Cho, Y. and Lim, S. C. 2006. Antimicrobial activity of medicinal herbs against Staphylococcus aureus. Kor. J. Plant Res. 19, 491-496.
  7. Cicerale, S., Lucas, L. J. and Keast, R. S. 2012. Antimicrobial, antioxidant and anti-inflammatory phenolic activities in extra virgin olive oil. Curr. Opin. Biotechnol. 23, 129-135. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2011.09.006
  8. Fernandes, A., Fernandes, I., Cruz, L., Mateus, N., Cabral, M. and de Freitas, V. 2009. Antioxidant and biological properties of bioactive phenolic compounds from Quercus suber L. J. Agric. Food Chem. 57, 11154-11160. https://doi.org/10.1021/jf902093m
  9. Cui, X., Trinh, K. and Wang, Y. J. 2010. Chinese herbal medicine for chronic neck pain due to cervical degenerative disc disease. Cochrane Database Syst. Rev. 20, CD006556.
  10. Deghrigue, M., Dellai, A., Akremi, N., Le Morvan, V., Robert, J. and Bouraoui, A. 2013. Evaluation of antiproliferative and antioxidant activities of the organic extract and its polar fractions from the Mediterranean gorgonian Eunicella singularis. Environ. Toxicol. Pharmacol. 36, 339-346. https://doi.org/10.1016/j.etap.2013.04.014
  11. Dhankhar, S., Dhankhar, S., Kumar, M., Ruhil, S., Balhara, M. and Chhillar, A. K. 2012. Analysis toward innovative herbal antibacterial and antifungal drugs. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 7, 242-248. https://doi.org/10.2174/157489112803521931
  12. Gülçin, İ. 2012. Antioxidant activity of food constituents: an overview. Arch. Toxicol. 86, 345-391. https://doi.org/10.1007/s00204-011-0774-2
  13. Guo, X. Y., Wang, J., Wang, N. L., Kitanaka, S. and Yao, X. S. 2007. 9, 10-Dihydrophenanthrene derivatives from Pholidota yunnanensis and scavenging activity on DPPH free radical. J. Asian Nat. Prod. Res. 9, 165-174. https://doi.org/10.1080/10286020500480522
  14. Heo, J. 1999. Donguibogam, pp. 689-692. In: Translated Edition by a Committee for Translation, Bupin Publishes, Seoul, Republic of Korea.
  15. Heo, S. J., Hwang, D. S., Lee, J. M., Lee, C. H., Lee, K. S. and Jang, J. B. 2014. Antimetastatic effects of Jipae-san by inflammation control and activation of innate immune system. J. Kor. Obstet. Gynecol. 27, 1-14.
  16. Hess, J. A. and Khasawneh, M. K. 2015. Cancer metabolism and oxidative stress: Insights into carcinogenesis and chemotherapy via the non-dihydrofolate reductase effects of methotrexate. BBA Clin. 3, 152-161. https://doi.org/10.1016/j.bbacli.2015.01.006
  17. Kaur, R., Kaur, J., Mahajan, J., Kumar, R. and Arora, S. 2014. Oxidative stress - implications, source and its prevention. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 21, 1599-1613. https://doi.org/10.1007/s11356-013-2251-3
  18. Hindle, A. G., Lawler, J. M., Campbell, K. L. and Horning, M. 2010. Muscle aging and oxidative stress in wild-caught shrews. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol. 155, 427-434. https://doi.org/10.1016/j.cbpb.2010.01.007
  19. Hosseinimehr, S. J. 2010. Flavonoids and genomic instability induced by ionizing radiation. Drug Discov. Today 15, 907-918. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2010.09.005
  20. Kalinowska, M., Bazdar, D. A., Lederman, M. M., Funderburg, N. and Sieg, S. F. 2013. Decreased IL-7 responsiveness is related to oxidative stress in HIV disease. PLoS One 8, e58764. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058764
  21. Kedare, S. B. and Singh, R. P. 2011. Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 48, 412-422. https://doi.org/10.1007/s13197-011-0251-1
  22. Kim, G. H., Kim, J. E., Rhie, S. J. and Yoon, S. 2015. The role of oxidative stress in neurodegenerative diseases. Exp. Neurobiol. 24, 325-340. https://doi.org/10.5607/en.2015.24.4.325
  23. Lee, M. H., Lee, J. W., Park, C., Han, M. H., Hong, S. H. and Choi, Y. H. 2015. Antioxidant, antimicrobial and anticancer properties of seven traditional herb-combined remedies. J. Life Sci. 25, 406-415. https://doi.org/10.5352/JLS.2015.25.4.406
  24. Lee, S. H. and Park, C. K. 2008. Anti-inflammatory effects of Ji-Pae-San water extract. Kor. J. Ori. Med. Prescrip. 16, 79-94.
  25. Loizzo, M. R., Bonesi, M., Di Lecce, G., Boselli, E., Tundis, R., Pugliese, A., Menichini, F. and Frega, N. G. 2013. Phenolics, aroma profile, and in vitro antioxidant activity of Italian dessert passito wine from Saracena (Italy). J. Food Sci. 78, C703-708. https://doi.org/10.1111/1750-3841.12110
  26. Lopes, A. C., Peixe, T. S., Mesas, A. E. and Paoliello, M. M. 2016. Lead exposure and oxidative stress: A systematic review. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 236, 193-238.
  27. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M. and Rice-Evans, C. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 26, 1231-1237. https://doi.org/10.1016/S0891-5849(98)00315-3
  28. Mileo, A. M. and Miccadei, S. 2016. Polyphenols as modulator of oxidative stress in cancer disease: New therapeutic strategies. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016, 6475624.
  29. Milne, L., Nicotera, P., Orrenius, S. and Burkitt, M. J. 1993. Effects of glutathione and chelating agents on copper-mediated DNA oxidation: pro-oxidant and antioxidant properties of glutathione. Arch. Biochem. Biophys. 304, 102-109. https://doi.org/10.1006/abbi.1993.1327
  30. Park, H. J., Kang, S. A., Lee, J. Y. and Cho, Y. J. 2012. Antioxidant activities of extracts from medicinal plants. Kor. J. Food Preserv. 19, 744-750. https://doi.org/10.11002/kjfp.2012.19.5.744
  31. Reis, J. S., Amaral, C. A., Volpe, C. M., Fernandes, J. S., Borges, E. A., Isoni, C. A., Anjos, P. M. and Machado, J. A. 2012. Oxidative stress and interleukin-6 secretion during the progression of type 1 diabetes. Arq. Bras. Endocrinol. Metabol. 56, 441-448. https://doi.org/10.1590/S0004-27302012000700006
  32. Saha, P. and Das, S. 2003. Regulation of hazardous exposure by protective exposure: modulation of phase II detoxification and lipid peroxidation by Camellia sinensis and Swertia chirata. Teratog. Carcinog. Mutagen. 2003 (Suppl 1), 313-322.
  33. Santos, S. A., Freire, C. S., Domingues, M. R., Silvestre, A. J. and Pascoal Neto, C. 2011. Characterization of phenolic components in polar extracts of Eucalyptus globulus Labill. bark by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 59, 9386-9393. https://doi.org/10.1021/jf201801q
  34. Servili, M., Sordini, B., Esposto, S., Urbani, S., Veneziani, G., Di Maio, I., Selvaggini, R. and Taticchi, A. 2013. Biological activities of phenolic compounds of extra virgin olive oil. Antioxidants (Basel) 3, 1-23. https://doi.org/10.3390/antiox3010001
  35. Uzasci, L., Nath, A. and Cotter, R. 2013. Oxidative stress and the HIV-infected brain proteome. J. Neuroimmune Pharmacol. 8, 1167-1180. https://doi.org/10.1007/s11481-013-9444-x
  36. Slimen, I. B., Najar, T., Ghram, A., Dabbebi, H., Ben Mrad, M. and Abdrabbah, M. 2014. Reactive oxygen species, heat stress and oxidative-induced mitochondrial damage. A review. Int. J. Hyperthermia 30, 513-523. https://doi.org/10.3109/02656736.2014.971446
  37. Slupphaug, G., Kavli, B. and Krokan, H. E. 200. The interacting pathways for prevention and repair of oxidative DNA damage. Mutat. Res. 531, 231-251. https://doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2003.06.002
  38. Suh, J. M. and Ryu, D. N. 1997. Effect of Chungkan-Haewul-Tang on anti-inflammatory analgesec action, immunocytes and MCF-7 cells. J. Kor. Obstet. Gynecol. 10, 69-83.
  39. Xu, X., Li, W., Lu, Z., Beta, T. and Hydamaka, A. W. 2009. Phenolic content, composition, antioxidant activity, and their changes during domestic cooking of potatoes. J. Agric. Food Chem. 57, 10231-10238. https://doi.org/10.1021/jf902532q
  40. Yang, J. H. and Lee, N. H. 2004. Skin permeation and anti-inflammatory effects of hydrolyzed products of Gardeniae fructus extracts. J. Kor. Pharm. Sci. 34, 115-123.
  41. Zhu, Y. Z., Huang, S. H., Tan, B. K., Sun, J., Whiteman, M. and Zhu, Y. C. 2004. Antioxidants in Chinese herbal medicines: a biochemical perspective. Nat. Prod. Rep. 21, 478-489. https://doi.org/10.1039/b304821g